50 Hz極低頻電磁場和1800 MHz射頻電磁場表觀遺傳學效應及其機制的研究.pdf

1、隨著科技的發(fā)展，各類電子產品、電力設備廣泛使用，由此產生的各種不同頻率的電磁場已經成為繼空氣、噪聲和水源污染后的第四大污染，嚴重影響和威脅人類健康。極低頻電磁場（ELF-EMF）和射頻電磁場（RF-EMF）是我們日常生活中接觸到的最普遍的兩種電磁場。許多研究表明，ELF-EMF和RF-EMF暴露與人類健康損害和部分疾病的發(fā)生具有一定的相關性，包括兒童白血病、腦腫瘤、Lou Gehrig疾病以及老年癡呆癥病等。由于雄性生殖器官對環(huán)境有害物

2、質非常敏感，隨著近年來精液質量下降和不育的人群越來越多，人們開始密切關注ELF-EMF和RF-EMF對雄性生殖健康的潛在危害。然而，目前關于ELF-EMF和RF-EMF是否具有明顯的雄性生殖毒性的流行病學研究以及實驗研究結果還很不一致，而且關于ELF-EMF和RF-EMF暴露對（男）雄性生殖毒性以及機制也均不清楚。因此系統(tǒng)的開展ELF-EMF和RF-EMF生殖毒性效應及其機制的研究，對于全面認識二者對人類健康的影響及防治具有重要的意義。

3、
　　DNA甲基化是表觀遺傳修飾的途徑之一。它指的是在 DNA甲基化轉移酶的作用下將活性S-腺甲硫胺酸(SAM)轉移至DNA分子胞嘧啶環(huán)5-C位點使其轉變?yōu)?-甲基胞嘧啶的過程。DNA甲基化是一種廣泛的表觀遺傳調控機制。一般而言，基因啟動子區(qū)高甲基化會抑制其表達。因此DNA甲基化在基因表達調控中起重要作用，而且廣泛參與了各種生命活動和疾病的發(fā)生。miRNA是表觀遺傳學調控的另一重要途徑，作為一類內源性非編碼小RNA（長度大約在19

4、~25核苷酸），它幾乎存在于所有的生物體中，包括動物、植物和病毒。miRNA主要的生物學功能是通過結合靶基因的3’非翻譯區(qū)從而在轉錄后水平上調控基因的表達。miRNA通過與靶基因的結合能夠抑制靶 mRNA的翻譯或提高mRNA的降解。miRNA介導的細胞調控是一種重要的表觀遺傳機制的調控途徑，人類基因組中約60％的基因都受到miRNA的調控，miRNA介導的細胞調控幾乎涉及參與全部的細胞進程，如細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡以及細胞周期等，

5、且miRNA與多種人類腫瘤和男性生殖障礙密切相關。
　　越來越多的證據表明，DNA甲基化和 miRNA對精子的生成和男性的生育能力至關重要。鑒于EMF暴露對雄性生殖健康的潛在危害值得關注，但現(xiàn)有研究未得出明確的結論。存在較大爭議的原因一方面可能與無標準暴露裝置，暴露頻率、強度、時間不一，檢測方法和細胞敏感性不同等有關；另一方面，不少研究發(fā)現(xiàn)ELF-EMF和RF-EMF沒有明顯的遺傳毒性。因此，本研究擬從表觀遺傳學這一新的角度入手，

6、系統(tǒng)的評價EMFs暴露是否對DNA甲基化以及miRNA等主要的表觀遺傳學調控產生影響；篩選關鍵性 DNA甲基化調控應答基因和 miRNA，并初步分析相關的DNA甲基化調控基因和miRNA在EMFs暴露過程中的功能及其機制。為進一步全面認識電磁輻射的損傷效應與醫(yī)學防護提供理論依據和研究材料。
　　本論文主要研究內容和結果如下：
　?。?）50 Hz ELF-EMF的表觀遺傳學研究
　?、僖圆煌妶鰪姸龋? mT，2 mT

7、和3 mT），間歇式暴露模式（5 min開10 min關）建立50 Hz ELF-EMF暴露條件下小鼠GC-2細胞的表觀遺傳學細胞研究模型。暴露72 h后采用 CCK-8和流式細胞術等分析方法發(fā)現(xiàn)，不同場強的50 Hz ELF-EMF暴露對GC-2細胞的形態(tài)、生長沒有明顯的影響，對GC-2細胞的細胞周期和凋亡也沒有明顯的影響。表明50 Hz ELF-EMF短期暴露在體外沒有明顯的細胞功能改變。
　?、谌蚪MDNA甲基化水平定量分

8、析發(fā)現(xiàn)：50 Hz ELF-EMF暴露后，1 mT暴露組GC-2細胞DNA的甲基化水平明顯降低；2 mT和3 mT暴露后，GC-2細胞全基因組甲基化水平升高（P<0.05），表明50 Hz ELF-EMF暴露可以導致GC-2細胞DNA異常甲基化。初步的機制研究表明，在50 Hz ELF-EMF暴露條件下，DNMT1、DNMT3b的mRNA和蛋白的表達水平明顯改變，表明相關的DNA甲基化轉移酶參與了50 Hz ELF-EMF致GC-2細胞

9、全基因組甲基化水平的改變。
　?、劾肈NA甲基化芯片初步篩選了50 Hz ELF-EMF暴露條件下主要的差異甲基化基因，建立了全基因組甲基化差異圖譜。其中有400多個基因發(fā)生了明顯的甲基化改變，表明50 Hz ELF-EMF暴露可能通過調控相關基因的甲基化產生生物學效應。通過對部分候選基因DNA甲基化狀態(tài)的進一步分析，結果發(fā)現(xiàn)Nod1、Lrrc9、Tagln等基因啟動子區(qū)明顯甲基化，且負調控相關基因的表達，表明相關基因不僅可以作

10、為50 Hz ELF-EMF暴露的候選標志物，而且可能在50 Hz ELF-EMF誘發(fā)的生物學效應中起重要作用。
　?、芾帽磉_譜芯片建立了50 Hz ELF-EMF暴露下差異基因表達譜。在1 mT暴露條件下共有84個差異表達基因（其中包括44個基因上調，40個基因顯著下調）；在3 mT暴露條件下，差異表達的基因共有324個，其中包括235上調的基因和89個下調的基因。進一步分析發(fā)現(xiàn)50 Hz ELF-EMF暴露下，Maoa、Bh

11、mt、Gng8、Ugt2b34、Dgat1和Adh1等基因可能是1 mT暴露條件下關鍵應答靶基因；而Cyp3a11、Ugt2b34、Adcy5、Ptgs1和Cyp2b23等基因是3 mT暴露條件下核心的靶基因。通過對相關基因表達驗證結合生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，這些關鍵性差異表達的基因主要涉及到免疫應激、組蛋白修飾、氧化應激等信號通路，提示50 Hz ELF-EMF可能影響相關的信號通路而產生生物學效應，為后續(xù)的深入研究提供了研究資料。

12、>　?、萃ㄟ^miRNA表達譜芯片建立了50 Hz ELF-EMF暴露條件下差異miRNA表達譜。結果表明：50 Hz ELF-EMF暴露可以明顯誘導miRNA差異表達。1 mT暴露組共有19個 miRNA的表達發(fā)生改變，其中有7個 miRNA表達上調，12個miRNA表達下調。在3 mT暴露組，差異表達的miRNA共有36個，其中有9個miRNA表達上調，27個miRNA表達下調。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在1 mT暴露組中， miR-211-3

13、p、miR-494-3p、miR-669f-3p和miR-1907是關鍵性應答miRNA。然而，在3 mT暴露組，miR-30e-5p、miR-210-5p、miR-224-5p、miR-196b-5p、miR-504-3p、miR-669c-5p和miR-455-3p是關鍵性應答miRNA。這些差異表達miRNA可能與ELF-EMF的生物學效應密切相關。采用GO和KEGG對miRNA靶基因所涉及的信號通路分析發(fā)現(xiàn)，相關的miRNA靶基

14、因主要參與mTOR信號通路、晝夜節(jié)律信號通路、p53信號通路、長期抑郁和 MAPK信號通路等信號通路，提示50 Hz ELF-EMF可能通過 miRNA影響上述信號通路和相關的生物學功能。我們的研究也表明這些顯著改變的miRNA可作為候選的生物標志物。
　?、奘状伟l(fā)現(xiàn)不同場強的50 Hz ELF-EMF能夠改變 GC-2細胞中miR-26b-5p的表達水平。單獨過表達或者沉默 miR-26b-5p對 GC-2細胞的生長、凋亡以及細

15、胞周期沒有明顯影響。但是過表達miR-26b-5p再暴露于3 mT50 Hz ELF-EMF會引起GC-2細胞由G0/G1期向S期轉換，提示miR-26b-5p與50 Hz ELF-EMF存在著明顯的交互作用。進一步的機制分析表明，CCND2是miR-26b-5p的一個直接的靶基因，miR-26b-5p的表達與CCND2的表達呈負相關。進一步的實驗表明50 Hz ELF-EMF與miR-26b-5p表達都可以改變CCND2 mRNA和蛋

16、白的表達水平從而影響細胞周期。相關研究首次表明miR-26b-5p-CCND2在GC-2細胞暴露于50 Hz ELF-EMF過程中對細胞周期的調控發(fā)揮重要作用。
　?。?）1800 MHz RF-EMF的表觀遺傳學研究
　?、僖圆煌任章剩? W/kg、2 W/kg和4 W/kg），間歇式暴露模式（5 min開10 min關）分別建立了1800 MHz RF-EMF暴露條件下小鼠GC-2細胞的表觀遺傳學細胞研究模型。暴露7

17、2 h后采用CCK-8和流式細胞術等方法分析發(fā)現(xiàn)：不同比吸收率的1800 MHz RF-EMF暴露對GC-2細胞的形態(tài)、生長沒有明顯的影響。不同比吸收率的1800 MHz RF-EMF對GC-2細胞的細胞周期和凋亡也沒有明顯的影響。
　?、诓捎肈ot blot方法分析1800 MHz RF-EMF暴露后GC-2細胞全基因組甲基化水平，分析結果表明1 W/kg和2 W/kg RF-EMF暴露時全基因組甲基化水平無明顯變化，而4 W/

18、kg RF-EMF暴露條件下GC-2細胞全基因組甲基化水平升高。進一步的機制分析發(fā)現(xiàn)1800 MHz RF-EMF可改變DNMTs mRNA和蛋白水平的表達。表明4 W/kg RF-EMF暴露能導致GC-2細胞DNA甲基化異常改變，且DNMTs參與了4 W/kg RF-EMF誘導的全基因組甲基化水平改變調控。
　?、劾?DNA甲基化芯片對差異甲基化調控基因進行了篩選，發(fā)現(xiàn)4 W/kg RF-EMF暴露條件下，共有132個差異甲基

19、化位點（54高甲基化和78低甲基化）。深入分析發(fā)現(xiàn)Cycs、Xpnpep3、Nmur2和Mob1a等基因的甲基化改變較為明顯，且負調控相應基因的表達，提示我們DNA甲基化可能參與了1800 MHz RF-EMF的生物效應過程。
　?、芡ㄟ^miRNA表達譜芯片建立了1800 MHz RF-EMF暴露條件下差異miRNA表達譜。分析結果表明4 W/kg RF-EMF暴露可以誘導 miRNA差異表達。通過qRT-PCR驗證和生物信息學分

20、析發(fā)現(xiàn)，miR-19a-3p、miR-291b-5p、miR-7684-5p、miR-6958-3p、miR-344g-5p、miR-669n和miR-1896可能是4 W/kg RF-EMF暴露條件下主要應答miRNA。這些差異表達miRNA可能與4 W/kg RF-EMF的生物學效應密切相關。
　?、萃ㄟ^表達譜芯片建立了4 W/kg RF-EMF暴露后全基因組表達譜。發(fā)現(xiàn)共511差異表達基因，其中255個基因表達上調，256個

21、基因表達下調。Signal-Net分析發(fā)現(xiàn)Ugt2a1和Cyp2b10可能是重要的靶基因。通過進一步驗證和信號通路分析發(fā)現(xiàn)，4 W/kg RF-EMF暴露條件下主要影響天然免疫反應、β干擾素細胞反應、嗅覺信號轉導、神經活性的配體-受體之間的相互作用、G蛋白偶聯(lián)受體等信號通路，提示RF-EMF暴露對一些基本生命活動有一定的影響。
　　⑥進一步對1800 MHz RF-EMF作用機制進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)4 W/kg RF-EMF暴露后

22、與天然免疫反應有關的基因，包括IL1а、IL6、IL10、Psg19、Oas1g和Cxcl10表達水平改變明顯；與嗅覺信號轉導有關的基因，包括Olfr50、Olfr128、Olfr167等基因的表達水平也發(fā)生了顯著的改變，表明免疫反應和嗅覺信號轉導信號通路可能在4 W/kg1800 MHz RF-EMF的生物效發(fā)揮著重要的作用，具有進一步深入研究的必要。
　　綜上所述，本實驗結果表明50 Hz ELF-EMF和1800 MHz R