魚腥藻PCC7120基因all3211-asl3212和asl4561-asl4562的初步研究.pdf

1、毒素-抗毒素系統(tǒng)廣泛存在于原核生物體內(nèi),通過系統(tǒng)中一對(duì)共表達(dá)的基因產(chǎn)物相互作用參與介導(dǎo)外界環(huán)境脅迫條件下細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或死亡的生理活動(dòng)。目前,只是對(duì)于大腸桿菌染色體上毒素-抗毒素系統(tǒng)mazEF和relBE研究相對(duì)深入,僅有少量的實(shí)驗(yàn)報(bào)導(dǎo)進(jìn)行藍(lán)細(xì)菌染色體TA系統(tǒng)的研究。本實(shí)驗(yàn)是首次對(duì)魚腥藻PCC7120體內(nèi)的TA系統(tǒng)同源基因進(jìn)行探索研究,在生物信息學(xué)理論分析的基礎(chǔ)上,借助雙啟動(dòng)子表達(dá)載體可單獨(dú)和同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的特性,分別控制預(yù)測(cè)的毒素基因和抗

2、毒素基因表達(dá),分析對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響,從而鑒定出目的基因的毒素-抗毒素作用;并且通過基因敲除原理構(gòu)建缺失突變株,確定目的基因在魚腥藻PCC7120體內(nèi)生理調(diào)節(jié)功能。主要包括以下幾方面內(nèi)容:
　　1)根據(jù)細(xì)菌染色體上TA系統(tǒng)基因的遺傳結(jié)構(gòu)特征,保守序列、編碼產(chǎn)物同源性及蛋白等電點(diǎn)等理化性質(zhì)預(yù)測(cè)和結(jié)構(gòu)域等二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)初步確定魚腥藻PCC7120染色體上兩對(duì)基因:all3211/asl3212為mazEF毒素-抗毒素系統(tǒng)同源基因,asl45

3、61/asl4562為relBE毒素-抗毒素系統(tǒng)同源基因;
　　2)構(gòu)建雙啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)載體,分別將毒素基因 all3211置于 PBAD啟動(dòng)子之下、抗毒素基因asl3212置于Plac啟動(dòng)子之下,誘導(dǎo)表達(dá),鑒定這對(duì)mazEF同源基因各自對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的毒素-抗毒素作用:all3211基因在 L-(+)-阿拉伯糖單獨(dú)誘導(dǎo)下對(duì)大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生毒性,當(dāng) L-(+)-阿拉伯糖和 IPTG同時(shí)誘導(dǎo)all3211/asl3212基因表達(dá)時(shí),

4、可解除all3211表達(dá)產(chǎn)物對(duì)對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的毒性,證明all3211和asl3212構(gòu)成一對(duì)毒素-抗毒素系統(tǒng),all3211為毒素基因,asl3212為抗毒素基因;
　　3)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-asl4561和pET28a-asl4562,在大腸桿菌中誘導(dǎo) asl4561和 asl4562表達(dá),鑒定這一對(duì) relBE同源基因的生理功能,并對(duì)asl4561-asl4562合基因蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明:IPTG誘導(dǎo)

5、 asl4561表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌有抑制作用,說明asl4561編碼蛋白產(chǎn)物作用于大腸桿菌生命調(diào)節(jié)系統(tǒng),造成損害;兩基因共表達(dá)時(shí),對(duì)大腸桿菌毒性作用減少,說明兩基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生相互作用,解除 asl4561表達(dá)產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的毒性;asl4561-asl4562合基因最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為 IPTG濃度0.8 mM、Kan濃度100μg/mL、在接種后培養(yǎng)1-1.5 h后加入誘導(dǎo)劑,28℃誘導(dǎo)6 h;
　　4)用 Kan抗性片段代替

6、 all3211-asl3212或 asl4561-asl4562基因?qū)?gòu)建的all3211-asl3212或asl4561-asl4562基因缺失突變株,在常規(guī)培養(yǎng)條件下構(gòu)建的魚腥藻缺失突變株生長(zhǎng)正常,沒有顯著影響細(xì)胞生理功能,為進(jìn)一步深入確定這兩對(duì)基因功能機(jī)理奠定基礎(chǔ);
　　5)根據(jù)之前在大腸桿菌中實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將毒素基因和合基因置于銅離子結(jié)合蛋白啟動(dòng)子 PPetE之下,構(gòu)建銅離子誘導(dǎo)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化魚腥藻 PCC7120 all3

7、211-asl3212和 asl4561-asl4562基因?qū)θ笔蛔冎?銅離子誘導(dǎo) all3211、asl4561表達(dá)產(chǎn)物對(duì)魚腥藻 PCC7120細(xì)胞具有毒性作用,當(dāng)銅離子誘導(dǎo)all3211/asl3212、asl4561/asl4562共表達(dá)時(shí),毒素蛋白對(duì)魚腥藻PCC7120細(xì)胞的毒性作用被抑制。并且在不同銅離子濃度培養(yǎng)條件下,隨著銅離子濃度加大,誘導(dǎo)毒素蛋白表達(dá)的突變株生長(zhǎng)量相應(yīng)減少,說明毒素蛋白導(dǎo)致大部分藻細(xì)胞死亡,一部分藻細(xì)胞