融合必需氨基酸多肽在魚腥藻PCC 7120中的表達(dá)及其條件優(yōu)化.pdf

1、魚腥藻PCC7120（Anabaenasp. PCC7120）屬于真細(xì)菌類中的一種進(jìn)行產(chǎn)氧性光合自養(yǎng)，能固氮的革蘭氏陰性多細(xì)胞絲狀原核生物；其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，優(yōu)點(diǎn)諸多如培養(yǎng)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)周期短，易于基因工程改良等已成為分子生物學(xué)和基因工程研究中的重要模式生物和穩(wěn)定的基因表達(dá)宿主。同時(shí)魚腥藻PCC7120富含蛋白質(zhì)、核酸、脂類等多種營(yíng)養(yǎng)要素，可作為動(dòng)物飼料蛋白資源的開(kāi)發(fā)和利用。本研究基于魚腥藻PCC7120遺傳學(xué)研究進(jìn)展和動(dòng)物飼料添加劑是氨基酸重要

2、終端市場(chǎng)，利用魚腥藻PCC7120偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)了能特異性表達(dá)多種必需氨基酸組成小肽的外源目的HEP234基因片段并對(duì)其進(jìn)行改良引入融合序列，通過(guò)基因工程手段體外構(gòu)建含上述目的基因片段的融合序列，強(qiáng)啟動(dòng)子的穿梭質(zhì)粒pHEP130并經(jīng)過(guò)三親結(jié)合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化魚腥藻PCC7120，篩選純化獲得質(zhì)粒穩(wěn)定性陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因藻株，對(duì)轉(zhuǎn)基因魚腥藻PCC7120進(jìn)行分子水平的檢測(cè)和蛋白水平的誘導(dǎo)表達(dá)，印跡雜交鑒定，證實(shí)外源目的基因在轉(zhuǎn)基因藻株的存在。此外，逐一優(yōu)

3、化了轉(zhuǎn)基因魚腥藻PCC7120生長(zhǎng)條件，確定了優(yōu)化條件培養(yǎng)下的轉(zhuǎn)基因藻的外源目的基因表達(dá)效率有明顯提高。其中本研究主要結(jié)果如下：
　　（1）根據(jù)魚腥藻PCC7120偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)了能特異性表達(dá)13種動(dòng)物必需氨基酸組成小肽的外源目的HEP234基因片段，該基因片段總長(zhǎng)78 bp；在此基礎(chǔ)上改良了HEP234使其N端引入TEV蛋白酶識(shí)別序列和GFP序列，C端引入His-tag標(biāo)簽；含外源目的基因片段的融合序列總長(zhǎng)為819 bp。實(shí)驗(yàn)過(guò)

4、程初成功構(gòu)建了含上述外源目的基因的融合序列，強(qiáng)啟動(dòng)子Lac C的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pHEP130，并通過(guò)三親結(jié)合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化魚腥藻PCC7120，經(jīng)3次純化篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因藻株。
　　（2）基因工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性是其高效表達(dá)目的基因產(chǎn)物的理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別采用平板稀釋法和平板計(jì)數(shù)法綜合比對(duì)了有無(wú)選擇壓力培養(yǎng)下連續(xù)傳代 E.coli NEB10β::pHEP130和PCC7120::pHEP130的生長(zhǎng)情況，并隨機(jī)挑取5代單克隆質(zhì)粒

5、PCR鑒定，結(jié)果證實(shí)E.coliNEB10β::pHEP130在147代質(zhì)粒未發(fā)生缺失，PCC7120::pHEP130在連續(xù)傳代10次仍能保持質(zhì)粒穩(wěn)定性。
　?。?）在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)條件（恒溫30℃，連續(xù)光照70μE m-2s-1，110 rpm振蕩）下得到了轉(zhuǎn)基因魚腥藻PCC7120有無(wú)氮源培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線，并確立了5~17d內(nèi)加氮條件下的轉(zhuǎn)基因藻生長(zhǎng)速率明顯高于缺氮培養(yǎng)。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選取加氮條件下培養(yǎng)15d的轉(zhuǎn)基因魚

6、腥藻PCC7120進(jìn)行目的基因融合蛋白的提取。
　?。?）純化后的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因高效表達(dá)藻株通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)，破碎提取，Ni柱純化，親和層析等技術(shù)手段可獲得目的基因融合蛋白，其最佳獲取條件為1mmol/L誘導(dǎo)物IPTG誘導(dǎo)，超聲破碎破壁處理提取。最后通過(guò)TEV蛋白酶酶切鑒定可初步獲得目的小肽HEP234 Protein。
　?。?）采用單因素控制變量法逐一探究種子液、溫度、pH、光照、外源碳源、氮源對(duì)轉(zhuǎn)基因魚腥藻PCC7120生物量