單一必需氨基酸調控乳蛋白合成機制的研究.pdf

1、近年來的研究結果表明，氨基酸不僅是蛋白質合成的底物，而且能夠作為生物信號直接參與蛋白質合成的調節(jié)。為研究必需氨基酸（EAA）通過細胞內信號途徑調控乳蛋白合成的機制，本文以牛乳腺上皮細胞系（MAC-T）為材料，系統(tǒng)研究了10種EAA對調控乳蛋白合成關鍵信號途徑的影響，以泌乳小鼠為模型，以仔鼠體增重衡量蛋白合成速率研究了調控乳蛋白合成潛力EAA對泌乳的影響及機制。
　　單一EAA對調控乳蛋白合成關鍵信號蛋白磷酸化程度的影響。本試驗以M

2、AC-T為試驗材料，試驗處理為在依次缺失一種EAA的DMEM/F12培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以含有全部EAA的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)為正對照，以缺失全部EAA的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)為負對照。分別缺失10種EAA對蛋白合成過程中主要信號蛋白磷酸化程度有極顯著影響，負對照 mTOR磷酸化程度下降58％，缺失Met、Ile或Val使 mTOR磷酸化程度分別下降38%、41%、42%；單一EAA缺失降低細胞內4eBP1的磷酸化程度，其中缺失Me

3、t、Ile、Thr和Lys分別下降39%、41%、36%和42%；缺失Met、Ile、Leu、Val時S6K1的磷酸化程度分別下降33%、38%、41%、40%；單一EAA缺失顯著提高eEF2磷酸化程度，其中缺失Met、Lle、Val磷酸化程度分別提高18%、20%、18%；缺失所有EAA和Met eIF2α磷酸化程度分別提高49%和39%。結果表明，單一EAA主要影響細胞內mTOR和GCN22條通路中關鍵信號蛋白的磷酸化，且關鍵信號蛋

4、白對完全缺失Met、Leu、Ile、Thr、Val、Lys反應敏感。
　　Met、Leu、Ile、Val對調控乳蛋白合成關鍵信號蛋白的影響。為研究信號蛋白反應敏感EAA的作用效果，以MAC-T為試驗材料，首先研究不同濃度EAA對調控蛋白合成關鍵信號蛋白的影響以確定細胞內EAA缺乏狀態(tài)，EAA缺乏時添加Met、Leu、Ile、Val以及這四種EAA兩兩組合。隨著EAA濃度的變化信號蛋白磷酸化程度符合米氏方程變化趨勢，EAA濃度20%

5、以下信號蛋白磷酸化程度變化幅度較大，當EAA濃度在30%-90%之間信號蛋白的磷酸化程度變化趨于穩(wěn)定，據此確定10%為后續(xù)研究EAA缺乏狀態(tài)的濃度。EAA缺乏狀態(tài)添加Met、Leu、Ile、Val以及這四種EAA兩兩組合，添加Leu、Ile、Met和Leu、Met和Ile、Leu和Ile mTOR磷酸化程度分別提高47%、69%、187%，200%和165%；單獨添加Leu、Ile、Val提高4eBP1的磷酸化程度，且同時添加Met和L

6、eu、Leu和Ile、Val和Ile有加性效果；添加Ile S6K1磷酸化程度提高63%，且Ile與其他三種氨基酸組合有加性作用。結果表明，EAA缺乏時添加Met、Leu、Ile、Val影響提高mTOR通路中信號蛋白的磷酸化程度，且四種氨基酸兩兩組合對信號蛋白的磷酸化有疊加作用。
　　Leu、Ile、Met、Thr對泌乳小鼠乳蛋白合成的影響。為評估體外試驗中乳蛋白合成調控潛力EAA對泌乳的貢獻及作用機制，首先確定小鼠蛋白缺乏狀態(tài)，

7、建立仔鼠體增重和不同蛋白水平的反應曲線，試驗選取分娩日期相近的孕鼠，日糧蛋白水平分別為6%、9%、12%、15%、18%、21%、24%,和27%。當蛋白水平低于21%時，隨蛋白濃度的增加仔鼠體增重增加，仔鼠體增重隨蛋白水平的提高成米氏反應趨勢，最大體增重一半時的蛋白水平為14%，最大體增重為113g；隨日糧蛋白水平提高泌乳小鼠乳腺組織中S6K1磷酸化程度提高，eEF2的磷酸化程度降低。根據以上結果，確定15%為日糧低蛋白，即負對照，2

8、1%為日糧高蛋白，即正對照，低蛋白基礎上分別添加Met、Leu、Ile、Thr。低蛋白日糧添加Met、Leu、Ile仔鼠體增重分別提高10%、11%、9%；添加Met、Leu、Ile和Thr后泌乳小鼠乳腺組織中mTOR的磷酸化程度分別提高了55%、34%,、47%和45%；必需氨基酸處理提高泌乳小鼠血漿IGF-1的濃度；仔鼠窩增重和乳腺組織中mTOR，相關系數為0.40。結果表明，低蛋白日糧添加Met、Leu、Ile獨立刺激乳蛋白合成速

9、率（仔鼠窩增重），且主要通過mTOR信號通路。
　　Met、Leu誘導內分泌變化對泌乳的影響。初探泌乳潛力EAA（Met、Leu）誘導內分泌的變化對泌乳的影響機制，本試驗以泌乳小鼠為模型，以仔鼠體增重衡量蛋白合成速率，低蛋白日糧添加Met、Leu。Met、Leu提高泌乳小鼠仔鼠體增重；添加Met提高泌乳小鼠血漿胰島素水平，Met、Leu提高血漿中IGF-1水平，提高乳腺組織中Akt的磷酸化程度；Met明顯增加泌乳小鼠胰腺中胰島素分

10、泌和肝臟中IGF-1的分泌，且Met、Leu引起的肝臟差異基因主要富集在胰腺分泌和胰島素信號途徑。
　　綜上，在體外，單一EAA主要影響細胞內mTOR和GCN2通路中關鍵信號蛋白的磷酸化，Met、Leu、Ile、Val對細胞內控制蛋白合成關鍵信號蛋白的磷酸化有單獨和疊加作用；在體內，蛋白缺乏日糧補充Met、Leu、Ile獨立刺激乳蛋白合成速率（仔鼠窩增重），可見“木桶理論”不適用于泌乳動物，且Met、Leu、Ile對乳蛋白合成速率