microRNA-182對大鼠肝再生的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、為了解microRNA(miRNA)對肝細(xì)胞增殖和肝再生的調(diào)節(jié)作用，本文用microRNAs(miRNAs)高通量測序方法檢測大鼠再生肝肝組織中的miRNAs表達(dá)差異性發(fā)現(xiàn)，microRNA-182(miR-182)等129種miRNAs的表達(dá)顯著上調(diào)。用qRT-PCR檢測其中肝再生相關(guān)miRNA在大鼠再生肝中表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，miR-21，miR-21*，miR-125a, miR-142，miR-143,miR-181c,miR-182

2、,miR-183,miR-191,miR-199a, miR-429等11條miRNAs的表達(dá)趨勢與高通量測序結(jié)果基本吻合。結(jié)合文獻(xiàn)報道和預(yù)測的靶基因的功能分析，本實(shí)驗(yàn)室前期選擇以miR-182為研究對象，對其生物學(xué)功能進(jìn)行體外研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用miR-182的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染大鼠正常肝細(xì)胞系BRL-3A時，與陰性對照相比，其模擬物顯著促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，它的抑制物顯著抑制肝細(xì)胞增殖。用雙熒光素酶(Dual-Lucifersae)報告系統(tǒng)

3、檢測表明，miR-182可直接與半胱天冬酶3（caspase3）的mRNA3'端不編碼區(qū)(3'UTR)結(jié)合，說明caspase3是miR-182的靶基因之一，caspase3是執(zhí)行凋亡的蛋白，因此我們推測miR-182通過抑制其靶基因caspase3促進(jìn)大鼠正常肝細(xì)胞系BRL-3A的增殖。
　　為進(jìn)一步檢測miR-182對大鼠肝再生的調(diào)節(jié)作用，我們構(gòu)建了miR-182的過表達(dá)質(zhì)粒和干涉質(zhì)粒，用大鼠尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別將miR-

4、182的過表達(dá)質(zhì)粒microRNA-182-C1和干涉質(zhì)粒microRNA-182-SC1轉(zhuǎn)入大鼠肝臟，首先檢測質(zhì)粒的熒光蛋白的表達(dá)動態(tài)，其次檢測目的基因miR-182的表達(dá)，通過摸索最佳的轉(zhuǎn)基因方式，成功的建立了最佳的轉(zhuǎn)基因模式，檢測肝系數(shù)發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)入microRNA-182-C1的實(shí)驗(yàn)組在PH72和PH120h時，肝系數(shù)顯著高于對照的肝系數(shù);PH后168h時與對照無顯著差異。而轉(zhuǎn)入microRNA-182-SC1的實(shí)驗(yàn)組在PH后168

5、h時，肝系數(shù)顯著低于對照，表明miR-182的過表達(dá)可以促進(jìn)大鼠肝再生，而當(dāng)干涉miR-182的表達(dá)時，大鼠肝再生無法如期完成。用qRT-PCR與Western blot方法檢測miR-182處理后再生肝中的9個與細(xì)胞增殖、凋亡、存活相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn):在上述再生肝組織中，miR-182對相關(guān)基因發(fā)生改變?yōu)? PH后72h時，caspase3、TNFRS1A、SMAD7、MAPK9上調(diào)，WNT4下調(diào)。PH后120h時，casp

6、ase3、TNFRS1A、TGFBR1、WNT4、MAP3K12、SMAD7、MAPK9、MAP2K1上調(diào)。PH后168h時，BCL2、TNFRS1A、TGFBR1、WNT4上調(diào)，caspase3、SMAD7、MAPK9下調(diào)。對相關(guān)蛋白變化的影響為-PH后72h時，WNT4、MAPK9、SMAD7、MAP3K12、MAP2K1等蛋白表達(dá)上調(diào)。PH后120h時，BCL2、WNT4、MAPK9、SMAD7、MAP3K12、MAP2K1等蛋白

7、表達(dá)上調(diào)。PH后168h時，WNT4表達(dá)上調(diào)，caspase3、TGFBR1、TNFRSF1A等蛋白表達(dá)下調(diào)，其他無有意義變化。這些結(jié)果提示PH后72-120h通過上調(diào)增殖相關(guān)基因來促進(jìn)肝再生，168h時的恢復(fù)正常，主要是通過抑制增殖相關(guān)基因和促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來抑制再生肝的異常增殖。
　　結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)研究“大鼠肝再生中肝細(xì)胞的蛋白表達(dá)變化預(yù)示的細(xì)胞增殖活動和凋亡活動”（結(jié)果待發(fā)表）發(fā)現(xiàn)，miR-182促進(jìn)MAPK、SMAD