針對(duì)LOX-1的吡咯-咪唑聚酰胺藥物支架對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄的影響.pdf

1、冠脈藥物洗脫支架(DES)部分解決了支架植入后的再狹窄問題，但也凸顯了局部內(nèi)皮化延遲及晚期血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。支架內(nèi)再狹窄(ISR)具有高度局部化的特性，從而使局部的基因沉默治療成為可能。對(duì)再狹窄相關(guān)致病基因的特異性沉默可以在解決再狹窄問題的同時(shí)避免局部內(nèi)皮化的延遲。吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)是一種能使特定基因沉默的化合物，與傳統(tǒng)基因沉默技術(shù)相比，它能夠不借助任何特殊載體進(jìn)入細(xì)胞核，同時(shí)，由于其分子量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、對(duì)核酸酶耐受、細(xì)胞攝取率及

2、生物利用度高、脂溶性強(qiáng)，因此更適合作為靶點(diǎn)基因沉默藥物用于支架系統(tǒng)。引起再狹窄的最主要病理過程是血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)在血管損傷后的增殖及由中膜向外膜遷移，從而導(dǎo)致的新生內(nèi)膜(NIH)形成。凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體(LOX-1)的激活及其與氧化應(yīng)激反應(yīng)之間的正反饋在VSMCs的增殖和遷移及NIH生成的過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，本研究建立離體及在體模型，著重探討針對(duì)LOX-1基因啟動(dòng)子的PIP能否特異性的抑制LOX-1基因

3、的表達(dá)，從而阻斷LOX-1與氧化應(yīng)激之間的正反饋，達(dá)到抑制VSMCs增殖、遷移和抑制支架內(nèi)再狹窄的目的，為開發(fā)新一代的藥物支架提供理論依據(jù)。研究主要由2部分組成：①合成能特異性沉默LOX-1基因的PIP化合物，并觀察其對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的VSMCs的增殖和遷移的影響；②制備能特異性沉默LOX-1的PIP藥物支架并將其植入大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)，觀察其對(duì)損傷血管局部支架內(nèi)再狹窄及再內(nèi)皮化的影響。
　　 一、針對(duì)LOX-1的PIP對(duì)ox-L

4、DL介導(dǎo)的VSMC增殖和遷移的影響
　　 目的：合成能特異性沉默LOX-1基因的PIP，觀察PIP對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移的影響。
　　 方法：構(gòu)建大鼠LOX-1基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，確定LOX-1基因AP-1增強(qiáng)子位點(diǎn)，根據(jù)吡咯-咪唑與DNA小溝的堿基配對(duì)原則確定能特異性沉默LOX-1基因的PIP結(jié)構(gòu)式并合成PIP化合物。體外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs并行α-肌動(dòng)蛋白(α

5、-SMA)特異性免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)共分為4組：Control組，Control+ox-LDL(10ug/ml)組，Control+ox-LDL+PIP (10-6mmol/L)組，Control+ox-LDL組+mismatch PIP (10-6mmol/L)組。通過Westblot法測定各組細(xì)胞LOX-1表達(dá)的情況，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法、噻唑藍(lán)比色(MTT)法測定各組細(xì)胞增殖的情況，通過Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)

6、胞的遷移情況。
　　 結(jié)果：使用膠原酶消化法培養(yǎng)原代VSMCs，細(xì)胞呈典型的“峰-谷”狀生長，經(jīng)α-SMA特異性免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，VMSCs胞漿呈陽性反應(yīng)。Ox-LDL(10μg/ml)能夠誘導(dǎo)VSMCs的細(xì)胞計(jì)數(shù)增多，MTT代謝率增高及細(xì)胞遷移增多(P<0.01)。PIP (10-6mmol/L)能夠明顯降低ox-LDL刺激引起的VSMCs LOX-1表達(dá)增高(P<0.01)，同時(shí)，PIP (10-6mmol/L)能夠顯著抑

7、制VSMCs的細(xì)胞計(jì)數(shù)增多、MTT代謝率增高及細(xì)胞遷移增多(P<0.01)。而mismatch PIP則無此效果。
　　 結(jié)論：針對(duì)LOX-1基因AP-1啟動(dòng)子位點(diǎn)的PIP能夠特異性的沉默LOX-1基因，并明顯減低ox-LDL刺激引起的VSMCs增殖和遷移。能特異性沉默LOX-1基因的PIP應(yīng)用于藥物支架系統(tǒng)預(yù)防支架植入后再狹窄的作用值得進(jìn)一步探討。
　　 二、化學(xué)基因沉默LOX-1藥物支架對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄及再

8、內(nèi)皮化的影響
　　 目的：制備能沉默LOX-1基因的PIP藥物支架，并將其植入大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)，觀察其對(duì)損傷血管局部支架內(nèi)再狹窄及再內(nèi)皮化的影響，并探討相應(yīng)機(jī)制。
　　 方法：按照1.0μg/mm2的載藥量構(gòu)建2.0×9.0mm PIP藥物支架。使用高效液相色譜法(HPLC)測定支架的體內(nèi)外藥物釋放動(dòng)力學(xué)。建立大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)植入藥物支架的動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)共分為4組：假手術(shù)組(n=10)，裸支架組(n=10)，PIP藥物支架組

9、(n=10)，mismatch PIP藥物支架組(n=10)。每組各3只動(dòng)物于支架植入14天后處死，留取少量標(biāo)本行HPLC檢測后，將含支架的血管行掃描電鏡檢查觀察各組的支架表面內(nèi)皮化情況。另外每組各6只動(dòng)物與支架植入28天后處死，留取少量標(biāo)本行HPLC檢測后，將標(biāo)本分為3部分，一部分-80°C保存，使用Real-time PCR及Westblot法檢測各組的LOX-1、NADPH氧化酶p22phox亞單位、NADPH氧化酶p47phox

10、亞單位的mRNA及蛋白表達(dá)情況，一部分組織風(fēng)干后勻漿，使用硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(TBARS)法測定各組的丙二醛(MDA)水平。最后一部分部分組織包埋入甲基丙烯酸甲酯中，切取5μm的切片，然后H-E染色后于顯微鏡下觀察并計(jì)算新生內(nèi)膜面積、新生內(nèi)膜厚度、損傷指數(shù)及炎癥指數(shù)。
　　 結(jié)果：PIP藥物支架在24h內(nèi)釋放超過90％，能夠成功建立大鼠腹主動(dòng)脈植入藥物支架的動(dòng)物模型。支架植入14d后，局部血管組織中有少量PIP藥物留存，掃描電

11、鏡顯示，裸支架、PIP藥物支架、mismatch PIP藥物支架表面均具有較高的內(nèi)皮化程度。支架植入28d后，局部血管組織中仍有微量PIP藥物留存；與對(duì)照組相比，裸支架組損傷血管局部的LOX-1、NADPH氧化酶p22phox亞單位、NADPH氧化酶p47phox亞單位的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高 (P<0.01)，MDA水平明顯升高(P<0.01)。PIP藥物支架能夠降低損傷血管局部的LOX-1、NADPH氧化酶p22phox亞單位

12、、NADPH氧化酶p22phox亞單位的mRNA、蛋白表達(dá)及MDA水平(P<0.01)。與裸支架組相比，PIP組支架內(nèi)新生內(nèi)膜面積明顯降低(P<0.05)，再狹窄程度明顯降低(P<0.05)；而mismatch PIP藥物支架的上述指標(biāo)與裸支架相比均無明顯差異(P>0.05)。此外，裸支架、PIP藥物支架、mismatch PIP藥物支架均具有相似的損傷指數(shù)及較低的炎癥評(píng)分。
　　 結(jié)論：以DMSO為溶劑的PIP藥物支架不具備良