納米銀涂層的膽道塑料支架研制及其抗菌效果和延長(zhǎng)支架通暢期的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、自1980年Sohendra N首次報(bào)道成功應(yīng)用膽道塑料支架進(jìn)行膽道梗阻引流以來(lái)，膽道支架已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在各種病因引起的膽道梗阻。膽道支架能安全有效地進(jìn)行膽道減壓引流，姑息性的膽道支架植入現(xiàn)已經(jīng)取代外科姑息膽腸內(nèi)引流或者放置T管外引流手術(shù)。然而，支架梗阻，隨之而發(fā)生的黃疸再發(fā)，并且常常伴有急性膽管炎是膽道支架術(shù)后的主要并發(fā)癥，發(fā)生率為10％～30％，經(jīng)常是發(fā)生急性梗阻性化膿性膽管炎，敗血癥而危及生命。膽道支架梗阻的原因包括支架的設(shè)計(jì)、支

2、架材料的性質(zhì)、支架表面的不平整形成微生物被膜和膽泥淤積。而微生物聚集形成微生物膜后導(dǎo)致的膽泥淤積、膽道感染是最常見(jiàn)原因和后果。至今為止，臨床尚缺乏有效抗菌膽道塑料支架能夠減少支架植入后的膽道感染、延長(zhǎng)支架通暢期提高生存率。
　　目前，納米材料已成為材料科學(xué)領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，納米銀(Nano Silver)就是將粒徑做到納米級(jí)的金屬銀單質(zhì)。納米銀粒徑大多在25納米左右，對(duì)大腸桿菌、淋球菌、沙眼衣原體等數(shù)十種致病微生物都有強(qiáng)烈的抑制和殺滅

3、作用，而且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性。動(dòng)物試驗(yàn)表明，這種納米銀抗菌微粉即使用量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)劑量的幾千倍，受試動(dòng)物也無(wú)中毒表現(xiàn)。同時(shí)，它對(duì)受損上皮細(xì)胞還具有促進(jìn)修復(fù)作用。值得一提的是，該產(chǎn)品遇水抗菌效果愈發(fā)增強(qiáng)，更利于疾病的治療。
　　納米銀殺菌具有以下特點(diǎn):
　　1.廣譜抗菌。納米銀顆粒直接進(jìn)入菌體與氧代謝酶（-SH）結(jié)合，使菌體窒息而死的獨(dú)特作用機(jī)制，可殺死與其接觸的大多數(shù)細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子等微生物。
　　2.強(qiáng)效殺菌。據(jù)研究發(fā)

4、現(xiàn)，Ag可在數(shù)分鐘內(nèi)殺死650多種細(xì)菌。納米銀顆粒與病原菌的細(xì)胞壁/膜結(jié)合后，能直接進(jìn)入菌體、迅速與氧代謝酶的巰基(-SH)結(jié)合，使酶失活，阻斷呼吸代謝使其窒息而死。獨(dú)特的殺菌機(jī)理，使得納米銀顆粒在低濃度就可迅速殺死致病菌。
　　3.滲透性強(qiáng)。納米銀顆粒具有超強(qiáng)的滲透性，可迅速滲入皮下2mm殺菌，對(duì)普通細(xì)菌、頑固細(xì)菌、耐藥細(xì)菌以及真菌引起的較深處的組織感染均有良好的殺菌作用。
　　4.修復(fù)再生。納米銀可促進(jìn)傷口愈合，促進(jìn)受損

5、細(xì)胞的修復(fù)與再生，去腐生肌，抗菌消炎改善創(chuàng)傷周圍組織的微循環(huán)，有效地激活并促進(jìn)組織細(xì)胞的生長(zhǎng)，加速傷口的愈合，減少疤痕的生成。
　　5.安全無(wú)毒。早在《本草綱目》中記載:生銀，無(wú)毒;美國(guó)公共衛(wèi)生局1990年《關(guān)于銀毒性的調(diào)查報(bào)告》中說(shuō)明:銀對(duì)人體無(wú)明顯毒副作用;納米銀是局部用藥，銀含量少，是最安全的用藥方式
　　6.無(wú)耐藥性。納米銀屬于非抗菌素殺菌劑:納米銀能殺滅各種致病微生物，比抗菌素更強(qiáng)，10nm大小的納米銀顆粒獨(dú)特抗菌

6、機(jī)理可迅速直接殺死細(xì)菌，使其喪失繁殖能力，因此，無(wú)法生產(chǎn)耐藥性的下一代，能有效避免因耐藥性而導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作久治不愈。
　　目的：
　　研發(fā)新型的納米銀涂層膽道塑料支架并研究此新型支架在體內(nèi)、外抗菌效果和延長(zhǎng)支架通暢期情況。
　　方法：
　　本研究以抗凝血性肝素作為聚陰離子，以具有抗菌作用的殼聚糖作為聚陽(yáng)離子復(fù)合具有長(zhǎng)效廣譜抗菌性能的納米銀，采用旋涂層層組裝方法構(gòu)建成納米銀涂層的膽道塑料支架。通過(guò)多層膜的表面形貌用A

7、FM和SEM觀察，材料表面分析及紫外分光光度計(jì)表征。體外納米銀釋放檢測(cè)和抗菌實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn):64只中國(guó)巴拿實(shí)驗(yàn)豬，雌雄不限，體重為30kg-40kg，隨機(jī)分為A組（對(duì)照組，control）32只:植入臨床用的COOK公司特氟龍膽道塑料支架（臨床常用）;B組(實(shí)驗(yàn)組，AgNP)32只:植入納米銀涂層的膽道塑料支架。每組各8只用作觀察支架通暢期和豬生存期。每組另24只按照在術(shù)后第4、12、24、48周經(jīng)豬耳緣靜脈抽血作血常規(guī)、生化、細(xì)胞因子

8、檢測(cè)分析豬的生存狀態(tài)。上述每一節(jié)點(diǎn)6只豬再手術(shù)抽門靜脈血、膽總管抽膽汁作細(xì)菌培養(yǎng)，取出膽道支架，切取膽管吻合口組織作檢測(cè)。豬均單籠飼養(yǎng)在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，專人飼養(yǎng)，觀察豬一般情況，如果豬出現(xiàn)胃納差，發(fā)熱，皮膚黃染等癥狀，立即終止實(shí)驗(yàn)觀察，再手術(shù)取標(biāo)本檢測(cè)。再手術(shù)從原切口進(jìn)腹，觀察腹腔粘連情況及膽管吻合口情況。剪開(kāi)吻合口觀察大體標(biāo)本后，取膽管吻臺(tái)口及上下1cm左右膽管組織分為4份，一份浸泡于10％福爾馬林中固定，進(jìn)行HE染色、Mass

9、on染色;一份用2.5％戊二醛固定行電鏡檢查;其余二份保存在-80℃冰箱內(nèi)備用。取肝臟組織一塊行HE染色.實(shí)驗(yàn)豬采用肌松劑法處死。整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理要求。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0 for Windows軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用Students' T-Test檢驗(yàn)，獨(dú)立樣本采用Mann.Whimey U檢驗(yàn)，配對(duì)樣本采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。P值小于0.05為兩組間有

10、顯著性差異，P值小于0.01時(shí)兩組間有非常顯著性差異。豬生存率采用Kaplan-Meier生存曲線分析。
　　結(jié)果：
　　紫外檢測(cè)用來(lái)表征納米銀的合成結(jié)果，肝素和殼聚糖呈近乎嚴(yán)格層層交替排列，這可能是由于基材表面最外層能被完全涂覆，而僅受到次外層的少量穿插。其中奇數(shù)層的接觸角比偶數(shù)層的接觸角要小，由于肝素的親水性要比殼聚糖的親水性要好，說(shuō)明奇數(shù)層肝素含量相對(duì)較多，偶數(shù)層殼聚糖含量相對(duì)較多。紫外分光光度儀檢測(cè)用來(lái)跟蹤載納米銀的

11、殼聚糖與肝素組裝過(guò)程。由于納米銀在433nm處的紫外吸收，多層膜在該處有最大吸收?？吹?，最大吸收值均隨組裝雙層膜數(shù)增加而增加并呈線性變化，說(shuō)明殼聚糖納米銀是逐層組裝的。隨著組裝雙層膜數(shù)的增加，多層膜的載銀量相應(yīng)增加，因此納米銀的吸收值增加。用AFM的敲打模式觀察了分別采用旋涂法和浸涂法組裝的多層膜表面形貌，結(jié)果顯示組裝方法對(duì)表面粗糙度有很大的影響，采用浸涂法組裝時(shí)的表面較粗糙(RMS=22.37nm)，而通過(guò)旋涂法組裝的多層膜則表面較平

12、坦（RMS=14.73nm）。同時(shí)旋涂使組裝時(shí)間縮短了近5個(gè)小時(shí)，這對(duì)于工藝化的實(shí)現(xiàn)大大節(jié)約了時(shí)間，提高了效率。
　　體外抗菌測(cè)試:殼聚糖納米銀/肝素多層膜(PET-1)則體現(xiàn)出了很強(qiáng)的抗菌性能，相同組成的多層膜在PBS緩沖溶液中放置1個(gè)月后(PET-2)的抗菌結(jié)果顯示了多層膜的長(zhǎng)效抗菌性。多層膜在PBS中放置了近一個(gè)月，仍體現(xiàn)出較好的抗菌性能。
　　手術(shù)情況:所有手術(shù)均順利完成，術(shù)中麻醉平穩(wěn)，無(wú)術(shù)中死亡發(fā)生，術(shù)后恢復(fù)順利，

13、無(wú)圍手術(shù)期死亡。無(wú)術(shù)后腸梗阻及明顯膽瘺發(fā)生。術(shù)后第4周，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組豬生活狀況良好，胃納可，無(wú)發(fā)熱和黃染。超聲掃描肝內(nèi)外膽管無(wú)擴(kuò)張，支架在膽道內(nèi)，位置良好。對(duì)比對(duì)照組（40.13±3.30 weeks），實(shí)驗(yàn)組(72.37±4.23 weeks)支架通暢期明顯延長(zhǎng)(p＜0.0001)。
　　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組生存率比較結(jié)果:在用于觀察生存率的各8只豬中，實(shí)驗(yàn)組8只豬平均生存時(shí)間是73.88±4.06周，而對(duì)照組8只豬平均生存時(shí)間是4

14、1.38±3.24周。Kaplan-Meier生存曲線顯示實(shí)驗(yàn)組生存率明顯延長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組膽道細(xì)菌感染情況:在每一節(jié)點(diǎn)4、12、48周，每批6只豬抽的膽汁細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率逐步升高，分別為0％，33.33％，50％和100％。而實(shí)驗(yàn)組從4周至48周，膽汁細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性。在抽到的膽汁培養(yǎng)陽(yáng)性細(xì)菌中，主要是大腸埃希氏菌，金黃色葡萄球菌，鵪鶉雞腸球菌D，陰溝腸桿菌，肺炎克雷白氏桿菌，糞腸球菌。其中，又以大腸埃希氏菌最

15、多見(jiàn)，占6/11(54.55％)。證實(shí)了納米銀涂層的膽道塑料支架良好的抗菌性。膽管吻合口組織H&E染色、Masson'strichrome染色在術(shù)后48周膽管吻合口組織切片結(jié)果顯示，對(duì)照組吻合口疤痕增生明顯，膠原纖維組織增多，肌纖維組織減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。術(shù)后肝功能變化:因?yàn)槟懙乐Ъ芄Ｗ钑?huì)導(dǎo)致血液總膽紅素升高，以直接膽紅素為主。同時(shí)膽道梗阻，伴隨著Y-GT升高。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組豬每4、12、24、48周均經(jīng)耳緣靜脈抽血生化檢查，結(jié)果顯