新型有序納米介生物活性玻璃作為骨組織工程支架材料的基礎(chǔ)性研究.pdf

1、目的：
　　 新型有序納米介孔生物玻璃80S(Mesoporous Bioactive Glasses80S，MBG80S，以下簡稱MBG)是復(fù)旦大學(xué)嚴(yán)曉霞等通過采用溶劑揮發(fā)誘導(dǎo)自組裝并結(jié)合溶膠-凝膠技術(shù)制備的一類新型材料。初步研究表明，其具有良好的體外生物活性和生物相容性。本文研究新型有序納米介孔生物活性玻璃在體外模擬實(shí)驗(yàn)中的力學(xué)性能變化及其機(jī)制，對骨形成蛋白-2(BMP-2)的吸附和緩釋效應(yīng)及其機(jī)制和對成骨細(xì)胞增殖，分化，礦

2、化以及粘附的作用，以探討其進(jìn)一步發(fā)展為骨組織工程支架材料的可能性。
　　 方法：
　　 第一部分實(shí)驗(yàn)中，將MBG80S粉劑壓制成型后，浸泡于SBF液中，10天中于各時(shí)間點(diǎn)取出后取一枚掃描電鏡觀察表面和內(nèi)部的變化，其余測試彈性模量和壓縮強(qiáng)度，并測定濾液中的離子濃度和PH變化。并以具有相同化學(xué)組分無介孔結(jié)構(gòu)的生物玻璃80S(BG80S，以下簡稱BG)為對照組平行測試。
　　 第二部分實(shí)驗(yàn)中，我們利用與rhBMP-2有

3、近似結(jié)構(gòu)、等電點(diǎn)和分子量的a-糜蛋白酶(a-Chy)為模擬蛋白，用I125同位素標(biāo)記作為示蹤，研究了MBG單體粉劑的吸附曲線，MBG成型片劑的吸附曲線和MBG80S片劑兩周的短期釋放曲線。同樣以BG為對照，分析其吸附和釋放機(jī)制。最后我們用I125同位素標(biāo)記rhBMP-2，描記MBG成型片劑三個月的釋放曲線，總結(jié)藥代動力學(xué)規(guī)律。
　　 第三部分實(shí)驗(yàn)中，用混合酶消化法分離大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)；成骨細(xì)胞與不同濃度的MBG浸

4、提液作用后，以空白培養(yǎng)液為對照，MTT法測定細(xì)胞增殖；PNPP法檢測堿性磷酸酶活性；礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)和面積測量分析MBG對成骨細(xì)胞礦化能力的影響。并測定MBG浸提液和空白培養(yǎng)液中的離子濃度。同時(shí)用0.0625％濃度的MBG浸提液配制不同濃度的rhBMP-2-MBG培養(yǎng)液，以空白培養(yǎng)液和不同濃度的rhBMP-2培養(yǎng)液為對照，MTT法測定細(xì)胞增殖；PNPP法檢測堿性磷酸酶活性。
　　 第四部分實(shí)驗(yàn)中用混合酶消化法分離大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞，

5、進(jìn)行原代培養(yǎng)；將細(xì)胞接種于MBG片劑上，培養(yǎng)3d，7d，11d，掃描電鏡觀察成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)和粘附情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.電鏡下MBG材料表面和內(nèi)部在4小時(shí)以后就有含碳羥基磷灰石(HCA)的生長，材料顆粒間縫隙的數(shù)量和尺寸都明顯減小，顆粒間相互融合。而BG80S材料表面和內(nèi)部無明顯晶體生長。力學(xué)測試表明初始強(qiáng)度相同的MBG80S和BG80S材料，在SBF液中浸泡4小時(shí)后力學(xué)性能發(fā)生了完全不同的變化，前者的彈性模量快

6、速上升100-150MPa，48小時(shí)后維持于250-200MPa，壓縮強(qiáng)度基本同步，在20-30MPa和30-40MPa之間。而BG快速下降，彈性模量和壓縮強(qiáng)度分別維持在20MPa左右和10MPa以下。離子濃度和PH變化，MBG和BG材料之間，MBG材料與粉劑之間也有明顯的不同。提示MBG的快速表面晶體生長是改變材料力學(xué)性能的主要原因，同時(shí)也改變了材料內(nèi)外的物質(zhì)交流。
　　 2.MBG和BG粉劑本身蛋白快速吸附在4小時(shí)時(shí)達(dá)到最大

7、，分別為47.080ug/mg和19.912ug/mg(蛋白/材料)，此后隨著MBG表面HCA晶體生長，其蛋白吸附仍有進(jìn)一步增長，而BG則沒有明顯變化。壓片后，MBG和BG材料的最大吸附量和吸附曲線形態(tài)較粉劑都有較大的變化，由于HCA晶體生長改變了材料內(nèi)外的物質(zhì)交流，MBG改變更大。在模擬蛋白a-Chy的短期釋放實(shí)驗(yàn)中，MBG和BG都有緩釋作用，但MBG緩釋更為平緩。
　　 在對rhBMP-2的釋放實(shí)驗(yàn)中，MBG表現(xiàn)出良好的緩釋

8、性能，其釋放行為符合Hugichi方程，MBG對rhBMP-2的50％緩釋時(shí)間為248.38天。
　　 3.0.5％以下各濃度組MBG浸提液均對成骨細(xì)胞增殖無影響，而1％濃度組對細(xì)胞增殖有輕度抑制，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義；各濃度MBG浸提液均可以增強(qiáng)堿性磷酸酶活性，與對照組相比，其中0.0625、0.125、0.25％濃度明顯提高ALP活性，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；0.0625％濃度時(shí)，礦化結(jié)節(jié)數(shù)目無明顯變化，而礦化結(jié)

9、節(jié)面積則明顯增加。提示MBG在低濃度時(shí)對成骨細(xì)胞由較好的促進(jìn)分化和礦化作用，對增殖無明顯作用。
　　 用0.0625％濃度的MBG浸提液配制不同濃度的rhBMP-2-MBG培養(yǎng)液培養(yǎng)成骨細(xì)胞后，與空白培養(yǎng)液相比各濃度組rhBMP-2-MBG培養(yǎng)液對細(xì)胞增殖和分化無明顯作用，但相同蛋白濃度的rhBMP-2-MBG培養(yǎng)液和rhBMP-2-細(xì)胞培養(yǎng)液相比有明顯差異，提示rhBMP-2與MBG浸提液中的產(chǎn)物可能在分子生物學(xué)水平上有某種相

10、互影響的作用。
　　 4.掃描電鏡下細(xì)胞形態(tài)分化良好，胞體伸長呈長梭形、多邊形或異型形，細(xì)胞表面具有較多的皺褶和微絨毛，眾多絲狀和纖維狀突起伸展相互聯(lián)接形成網(wǎng)狀。成骨細(xì)胞在材料表面粘附良好，細(xì)胞相互之間結(jié)合良好。提示MBG對成骨細(xì)胞有良好的生物相容性和粘附性能。
　　 結(jié)論：
　　 新型有序納米介孔生物玻璃80S(MBG80S)在體外試驗(yàn)中，具有良好的力學(xué)性能，對中低分子有良好的吸附和緩釋作用，對成骨細(xì)胞有良好的