蠶絲作為軟骨組織工程支架材料的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：進(jìn)一步證實(shí)蠶絲具有良好的生物相容性；觀察蠶絲的體內(nèi)降解過(guò)程；探討鈣鹽溶解對(duì)蠶絲降解性的影響；比較微溶蠶絲、切割蠶絲與PGA在細(xì)胞黏附性方面的差異；探討用蠶絲作為組織工程支架體外構(gòu)建軟骨的可行性。 方法：實(shí)驗(yàn)分三個(gè)部分：第一部分蠶絲生物相容性及降解性研究，將脫膠后的蠶絲在CaCL．H2O(摩爾比1：8)溶液中按不同時(shí)間進(jìn)行溶解，沉淀于直徑lOmm培養(yǎng)皿底部自然干燥呈圓盤(pán)狀，剪刀剪成數(shù)塊3×5mm2大小薄片。取實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠5

2、4只，隨機(jī)分為：cacl2處理20min組；cacl2處理60min組；未處理組，每組18只，每只小鼠背部皮下埋植3塊材料。埋植術(shù)后1月、2月、3月、4月、6月、8月，每組各處死小鼠2只，取出材料。埋植術(shù)后12月，處死剩余小鼠。行大體觀察、組織學(xué)切片觀察蠶絲的降解情況、降解產(chǎn)物對(duì)組織的影響及鈣鹽溶解對(duì)其降解性的影響。第二部分蠶絲與PGA的細(xì)胞黏附性比較研究，通過(guò)親水性測(cè)試及掃描電鏡觀察切割蠶絲性能及結(jié)構(gòu)變化，取新生兔關(guān)節(jié)軟骨消化分離獲取

3、軟骨細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增，將傳至第3代細(xì)胞消化下來(lái)制成l×105／ml濃度單細(xì)胞懸液，以每孔105個(gè)細(xì)胞(1m1)分別接種子微溶蠶絲材料和切割蠶絲材料及PGA材料上培養(yǎng)24h，然后通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法及MTT法作黏附細(xì)胞數(shù)檢測(cè)，評(píng)價(jià)黏附率。第三部分蠶絲復(fù)合兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程軟骨，選新生兔關(guān)節(jié)軟骨消化分離獲取的原代軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞，分別試用切割蠶絲及PGA為支架材料，采用體外培養(yǎng)4周構(gòu)建組織工程軟骨。通過(guò)倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、組

4、織學(xué)及免疫學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)新生軟骨。 結(jié)果：第一部分蠶絲生物相容性及降解性研究結(jié)果：術(shù)后動(dòng)物無(wú)不良反應(yīng)，術(shù)區(qū)及鄰近皮膚無(wú)紅腫、水腫、破潰及異常隆起等。埋植術(shù)后1月、2月、3月、4月時(shí)可見(jiàn)材料表面包裹一薄層纖維結(jié)締組織，外形較植入時(shí)略有縮小。6個(gè)月時(shí)cacl2處理60min組發(fā)現(xiàn)1塊材料消失。8個(gè)月時(shí)cacl2處理20min組有1塊及caclz處理60min組有2塊材料消失。12個(gè)月時(shí)分別有7塊和9塊消失。以上結(jié)果提示蠶絲已降解可能。組

5、織病理學(xué)檢查可見(jiàn)，最初幾月各組均可見(jiàn)異物巨細(xì)胞排列于蠶絲周?chē)?，隨月份增加逐漸減少，少見(jiàn)白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。體內(nèi)埋植2月后多數(shù)切片均可見(jiàn)蠶絲有裂解現(xiàn)象，cacl2處理60min組較20min組出現(xiàn)早且明顯。6個(gè)月的組織切片中可以觀察到蠶絲局部結(jié)構(gòu)消融現(xiàn)象。第二部分蠶絲與PGA的細(xì)胞黏附性比較研究結(jié)果：經(jīng)過(guò)切割處理，蠶絲親水性明顯增加，掃描電鏡下可見(jiàn)經(jīng)切割后蠶絲表面有更多的微絲剝脫，使得網(wǎng)孔增加、孔隙減小，絲與絲之間連接增加。細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)

6、得微溶蠶絲、切割蠶絲及PGA三種材料黏附率分別為67．3％、84．2％、77．8％，MTT法測(cè)得三種材料黏附率分別為68．3％、83．3％、77％。各組數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析，微溶蠶絲組與切割蠶絲組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，切割蠶絲組與PGA組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第三部分蠶絲復(fù)合兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程軟骨研究結(jié)果：倒置相差顯微鏡下見(jiàn)軟骨細(xì)胞接種24h后單個(gè)或成團(tuán)吸附在支架纖維表面或密布于纖維孔隙中。培養(yǎng)5天時(shí)，可見(jiàn)大部分纖維上均有細(xì)胞纏繞，纖維增粗。培養(yǎng)

7、1周時(shí)外觀有所增大，復(fù)合物密不透光。復(fù)合物培養(yǎng)2周時(shí)掃描電鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞呈多角狀伸展開(kāi)來(lái)，胞外基質(zhì)分泌旺盛，黏附并包繞蠶絲纖維，成片狀沉積覆蓋于材料表面并進(jìn)入支架內(nèi)部。體外培養(yǎng)4周后，進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，可見(jiàn)蠶絲構(gòu)建的組織工程化軟骨組織能形成近似于正常軟骨的結(jié)構(gòu)。免疫組化檢測(cè)可見(jiàn)蠶絲構(gòu)建的軟骨組織中有被染成棕黃色的II型膠原。 結(jié)論：(1)天然蠶絲具有良好的生物相容性，脫去絲膠后埋植皮下1月后少見(jiàn)急性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。(2)蠶絲體內(nèi)

8、1年左右可以降解，降解產(chǎn)物不產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。(3)經(jīng)過(guò)鈣鹽溶解處理后降解時(shí)間加快，溶解20分鐘與60分鐘在降解率方面比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而20分鐘微溶解對(duì)蠶絲結(jié)構(gòu)性能影響較小，更適合用作組織工程支架材料。(4)切割蠶絲具有良好的親水性和細(xì)胞黏附性，細(xì)胞黏附率較未切割組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；和PGA相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(5)切割蠶絲纖維制作的支架能夠維持軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)的三維環(huán)境條件。孔隙大小適中，利于細(xì)胞進(jìn)入材料內(nèi)部。(6)軟骨細(xì)胞在蠶絲支架上生