脫細(xì)胞組織工程血管支架材料的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著社會的發(fā)展，心血管疾病和創(chuàng)傷日益成為威脅人們健康及生命的重要因素。冠狀動脈搭橋術(shù)、嚴(yán)重創(chuàng)傷致血管損傷和缺損、多種血管移植手術(shù)在外科中的應(yīng)用以及整形外科游離皮瓣轉(zhuǎn)移中血管蒂的長度不足等，使得血管移植材料的研究日益成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。作為一種全新的技術(shù)，組織工程在提供合適的血管移植物研究方面取得了迅速的發(fā)展。組織工程血管是一種用組織工程學(xué)方法構(gòu)建的具有良好生物相容性和力學(xué)特性的血管替代物，其基本的構(gòu)件是血管支架材料和種子細(xì)胞，而血管支架

2、的研究一直是目前血管組織工程研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和重點(diǎn)。組織工程血管支架材料主要分為人工合成的生物可降解高分子聚合物和天然生物支架材料兩大類。高分子可降解材料的應(yīng)用目前雖然得到廣泛的認(rèn)可，但是由于材料價(jià)格較為昂貴，合成技術(shù)要求高，難以大規(guī)模應(yīng)用。另外由于材料本身的性質(zhì)影響，其對種子細(xì)胞的親和性不足，構(gòu)建的組織工程血管順應(yīng)性尚不理想，對血液動力學(xué)方面可能會有較大影響。而作為天然生物支架材料的脫細(xì)胞血管基質(zhì)，由于其與細(xì)胞親和力強(qiáng)，能為細(xì)胞生長、繁

3、殖、分化提供近似體內(nèi)組織發(fā)育的細(xì)胞外基質(zhì)支架，且生物相容性、順應(yīng)性以及免疫排斥性低等特點(diǎn)都優(yōu)于合成材料，因此在血管組織工程中得到越來越多的重視和應(yīng)用。
　　目前國內(nèi)外常用的主要脫細(xì)胞方法包括:機(jī)械法，酶消化法，化學(xué)去垢劑法等。以上幾種方法各有利弊，物理方法對支架結(jié)構(gòu)的破壞較小但脫細(xì)胞效果較差，而化學(xué)去垢劑方法脫細(xì)胞效果較好卻容易破壞血管的膠原結(jié)構(gòu)。另外，在利用化學(xué)去垢劑制備生物材料時(shí)，去垢劑的殘留會導(dǎo)致脫細(xì)胞生物材料具有一定程度的

4、細(xì)胞毒性。酶消化法制備脫細(xì)胞基質(zhì)材料簡單易行，但是高濃度的酶可引起支架膠原結(jié)構(gòu)的破壞，而低濃度酶又無法完全去除動脈壁深部的細(xì)胞成份，脫細(xì)胞效果并不理想。因此尋找一種更高效和安全的脫細(xì)胞方法一直是脫細(xì)胞組織工程血管支架研究的一個熱點(diǎn)。
　　同其它異體移植材料一樣，脫細(xì)胞血管支架的研究應(yīng)用也面臨著傳播供體潛在疾病以及在移植物處理應(yīng)用過程中二次污染的問題。傳統(tǒng)的生物材料滅菌方法主要有以環(huán)氧乙烷為代表的化學(xué)法和以鈷60照射為代表的電離輻射

5、法兩種。但是這些方法都存在操作要求條件較高，過程較復(fù)雜以及可能降低材料的機(jī)械強(qiáng)度等缺點(diǎn)。因此，我們希望找到一種操作簡便、滅菌效果確實(shí)、費(fèi)用低廉、殘留低且對材料的生物特性影響較小的脫細(xì)胞血管支架消毒方法。
　　目前仍沒有足夠的證據(jù)表明細(xì)胞能夠長入脫細(xì)胞血管基質(zhì)支架材料內(nèi)部。因此，如何在保留脫細(xì)胞血管支架足夠機(jī)械強(qiáng)度的前提下，提高脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料的疏松性和孔隙率，這也是目前組織工程脫細(xì)胞血管支架研究中一個亟待解決的難點(diǎn)。
　　

6、最后，脫細(xì)胞血管材料制備后如何長期保存也是一個需要解決的問題，我們希望找到一種簡單可行的儲存技術(shù)來長期保存制備的脫細(xì)胞血管支架以達(dá)到臨床和科研上“隨取隨用”的目的。
　　本實(shí)驗(yàn)采用天然血管作為組織工程血管支架的來源：
　　1．通過反復(fù)凍融及超高壓處理，摸索上述處理與完全去除血管材料固有細(xì)胞所需核酸酶酶濃度的關(guān)系，以及對血管材料生物力學(xué)特性的影響，從而得到一種體外快速高效構(gòu)建組織工程化小血管支架材料的方法。
　　2．在上

7、述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們將0.1％的過氧乙酸作為脫細(xì)胞血管支架的消毒劑，對經(jīng)過氧乙酸處理的脫細(xì)胞血管支架進(jìn)行組織學(xué)評估、超微結(jié)構(gòu)觀察、生物力學(xué)以及細(xì)胞毒性測定，以觀察過氧乙酸對脫細(xì)胞血管支架材料生物相容性和生物力學(xué)特性的影響。
　　3．利用超聲處理的空化效應(yīng)，對制備的脫細(xì)胞血管支架進(jìn)行不同強(qiáng)度及不同時(shí)間的超聲處理。對經(jīng)超聲處理后支架材料的孔隙大小、生物相容性、細(xì)胞毒性、生物力學(xué)效應(yīng)及與種子細(xì)胞親和性進(jìn)行評估，從而得出脫細(xì)胞血管材料基質(zhì)

8、疏松的最佳超聲強(qiáng)度參數(shù)以及作用時(shí)間。
　　4．利用冷凍干燥技術(shù)，對制備好的脫細(xì)胞血管支架進(jìn)行真空冷凍干燥處理。通過對經(jīng)凍干處理并保存的脫細(xì)胞血管支架材料的各種生物學(xué)特性的分析，以判斷冷凍干燥技術(shù)是否可以作為脫細(xì)胞生物支架材料長期保存的一種方法。
　　本研究結(jié)果表明：
　　1．采用反復(fù)凍融加超高壓結(jié)合低濃度核酸酶消化、緩沖液沖洗的脫細(xì)胞方法可以在較短的時(shí)間內(nèi)完全除去支架內(nèi)細(xì)胞成份，且對材料的主要生物力學(xué)指標(biāo)以及膠原結(jié)構(gòu)無

9、明顯影響。相對于單一的超高壓處理或反復(fù)凍融處理，反復(fù)凍融及超高壓兩種方法結(jié)合不僅能明顯提高制備脫細(xì)胞血管支架的效率，其對于超高壓設(shè)備參數(shù)的要求也明顯降低，使得超高壓生物處理這一過程在國產(chǎn)設(shè)備上即能完成。因此，其為今后脫細(xì)胞血管支架的快速高效制備提供一種新的思路和方法。
　　2．體外試驗(yàn)表明經(jīng)過0.1％濃度過氧乙酸處理過的脫細(xì)胞血管材料，其細(xì)胞毒性、生物力學(xué)及膠原含量與未經(jīng)過氧乙酸處理前相比沒有明顯的差異。因此應(yīng)用0.1％濃度過氧乙

10、酸作為組織工程血管支架制備過程中的消毒滅菌劑是可行的。
　　3．超聲處理參數(shù)為強(qiáng)度300瓦，處理間隔1秒，處理時(shí)長1分鐘時(shí)，脫細(xì)胞兔股動脈支架材料的疏松程度和材料的生物力學(xué)強(qiáng)度處于一個較均衡的水平。即材料疏松程度較未處理前明顯提高，而生物力學(xué)強(qiáng)度無明顯降低。因此，針對不同長度及厚度的血管材料，應(yīng)用不同參數(shù)的超聲處理，可以達(dá)到在不明顯降低材料生物力學(xué)特性的前提下，使脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料結(jié)構(gòu)明顯疏松的目的。
　　4．經(jīng)過凍干保存處

11、理的脫細(xì)胞血管材料，其細(xì)胞毒性、生物力學(xué)以及其自身膠原結(jié)構(gòu)與未經(jīng)處理前相比沒有明顯的差異,凍干保存后的材料在體內(nèi)依然具有良好的生物相容性。因此我們認(rèn)為：冷凍干燥處理作為組織工程脫細(xì)胞血管支架此類管狀生物材料的長期儲存方法是可行的。
　　綜上所述，通過系列的試驗(yàn)，我們找到了一種組織工程脫細(xì)胞血管支架材料快速制備、簡便高效消毒及長時(shí)間儲存的方法。同時(shí)我們也初步解決了脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料結(jié)構(gòu)致密，種子細(xì)胞無法長入的問題，在組織工程脫細(xì)胞血