基于脫細(xì)胞基質(zhì)支架的輸尿管組織工程研究.pdf

1、輸尿管作為腹膜后位器官，損傷發(fā)生的機(jī)率很低，但近年來隨著腔鏡技術(shù)在臨床中的廣泛應(yīng)用，輸尿管損傷發(fā)生的概率逐年升高。常規(guī)手術(shù)治療方式（輸尿管斷端吻合，輸尿管的再植，膀胱成形術(shù)等）可以恢復(fù)輸尿管結(jié)構(gòu)的連續(xù)性，而不能完全恢復(fù)其功能，且常伴有一些術(shù)后并發(fā)癥，例如:復(fù)發(fā)性狹窄，漏尿以及腎臟損害等。隨著組織工程技術(shù)在泌尿系統(tǒng)中的廣泛應(yīng)用，為輸尿管的修復(fù)重建提供了新的契機(jī)。
　　組織工程學(xué)融合了材料學(xué)、生命科學(xué)和工程學(xué)的理念，屬于前沿交叉學(xué)科領(lǐng)

2、域，研究的最終目的是體外構(gòu)建具有生物學(xué)功能的工程化輸尿管，替換體內(nèi)受損的輸尿管組織，達(dá)到臨床治愈的目標(biāo)。隨著組織工程技術(shù)在泌尿系統(tǒng)廣泛而深入的研究，體外構(gòu)建工程化輸尿管的研究也有了很多突破性的進(jìn)展，但尚未構(gòu)建出理想的工程化輸尿管組織，用于臨床的治療。其中支架材料問題是其主要原因之一。輸尿管細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分較為復(fù)雜，現(xiàn)階段技術(shù)條件很難在體外完全模擬出細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境。脫細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，使得制備脫細(xì)胞基質(zhì)材料成為可能，受到了廣

3、泛的關(guān)注和研究。
　　脫細(xì)胞基質(zhì)材料獨(dú)有的特點(diǎn)是將細(xì)胞成分從組織或器官中清除，同時(shí)能夠很好地保留細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分，因而是較為理想的組織工程支架材料。輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)常用的制備方法為物理攪拌同時(shí)結(jié)合化學(xué)洗滌劑的洗脫作用，來達(dá)到脫細(xì)胞效果，這一制備過程需消耗較長(zhǎng)的時(shí)間，且制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的成分常遭到破壞。此外，長(zhǎng)時(shí)間的攪拌和化學(xué)洗滌劑作用，也會(huì)破壞脫細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響組織工程輸尿管的構(gòu)建。因此，探尋一種快速，便捷的脫

4、細(xì)胞方案，使制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞成分被完全清除，同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分得到很好地保留，對(duì)以后的輸尿管再造研究具有重要的意義。
　　既往的研究報(bào)道，細(xì)胞外基質(zhì)在調(diào)控干細(xì)胞分化中扮演著重要的角色。 DeQuach等人的研究表明，骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)能夠促進(jìn)肌源性干細(xì)胞向骨骼肌細(xì)胞分化，心臟脫細(xì)胞基質(zhì)能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。有文獻(xiàn)報(bào)道脫細(xì)胞基質(zhì)的硬度在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化起到重要的作用，質(zhì)地較為堅(jiān)硬的基質(zhì)有利于間充質(zhì)干細(xì)

5、胞的成骨分化，相反質(zhì)地較軟的基質(zhì)更有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化。此外，也有關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì)中某些組分可以促進(jìn)干細(xì)胞的分化的報(bào)道。但關(guān)于輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)成分在促進(jìn)干細(xì)胞分化方面的研究尚未有報(bào)道。
　　基于以上問題的分析，本論文主要從以下三方面進(jìn)行了相關(guān)研究:
　　第一部分:輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的灌注制備及條件優(yōu)化
　　目的:探索灌注系統(tǒng)在制備輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)中的可行性，并對(duì)制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)且詳細(xì)地評(píng)價(jià)。
　

6、　方法:利用輸尿管本身存在的管腔結(jié)構(gòu)，通過灌注系統(tǒng)制備輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)。根據(jù)化學(xué)洗滌劑的不同特性設(shè)置3個(gè)不同的灌注組，單純SDS組、單純TritonX-100組以及聯(lián)合組(TritonX-100+SDS)。
　　結(jié)果:HE染色和DAPI染色顯示聯(lián)合組制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)中沒有明顯的核物質(zhì)殘留，DNA定量和凝膠電泳證實(shí)了這一結(jié)果。Masson's三色染色、AlcianBlue染色、膠原含量測(cè)定和GAG含量測(cè)定顯示聯(lián)合組保留了輸尿管

7、脫細(xì)胞基質(zhì)三維膠原結(jié)構(gòu)和生物活性成分。掃描電鏡觀察聯(lián)合組制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)表面存在大量的孔隙結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論:灌注系統(tǒng)可用于輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的制備，篩選出一套比較理想的脫細(xì)胞方案，制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)可作為輸尿管組織工程再造。
　　第二部分:輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的生物相容性評(píng)價(jià)和再細(xì)胞化
　　目的:對(duì)制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià)，并進(jìn)行再細(xì)胞化研究。
　　方法:通過AO/PI染色和MTT檢測(cè)評(píng)價(jià)輸尿

8、管脫細(xì)胞基質(zhì)的生物相容性;將犬膀胱平滑肌細(xì)胞種植在輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的表面，觀察脫細(xì)胞基質(zhì)中細(xì)胞的生長(zhǎng)行為。
　　結(jié)果:AO/PI染色和MTT檢測(cè)顯示平滑肌細(xì)胞可在輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)浸提液中生長(zhǎng)和增殖;HE染色、DAPI染色和PCNA染色顯示犬膀胱平滑肌細(xì)胞可在輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)中粘附、生長(zhǎng)、遷移和增殖。
　　結(jié)論:制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)具有良好的生物相容性，可用做輸尿管組織工程的支架材料。
　　第三部分:輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的

9、化學(xué)成分誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞的分化
　　目的:探尋輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的化學(xué)成分是否可誘導(dǎo)干細(xì)胞分化。
　　方法:將犬脂肪干細(xì)胞種植在鋪有輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)消化液的蓋玻片上，觀察脂肪干細(xì)胞的分化情況。
　　結(jié)果:免疫熒光染色顯示脂肪干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化，WesternBlot檢測(cè)顯示有平滑肌蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的化學(xué)成分可以誘導(dǎo)犬脂肪干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化。
　　綜上所述，本論文將灌注系統(tǒng)引入到輸

10、尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的制備中，并成功篩選出一套適用于制備犬輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的脫細(xì)胞方案。同時(shí)對(duì)制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)且詳細(xì)的評(píng)價(jià)，證實(shí)制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)很好地清除了細(xì)胞核成分，同時(shí)較好地保留了輸尿管的三維結(jié)構(gòu)和生物活性成分。并且驗(yàn)證了所制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)具有良好的生物相容性，進(jìn)行了再細(xì)胞化實(shí)驗(yàn)，表明優(yōu)化后的脫細(xì)胞方案所制備的輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)可用作輸尿管組織工程的支架材料。進(jìn)一步研究表明輸尿管脫細(xì)胞基質(zhì)的化學(xué)組分可促進(jìn)犬脂肪干