以異種脫細(xì)胞角膜基質(zhì)構(gòu)建組織工程兔角膜前板層的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、角膜是構(gòu)成眼屈光間質(zhì)的重要組成部分，同時也是重要的天然防御屏障。目前，全球約有超過1000萬人承受著角膜盲的痛苦。迄今為止，同種異體角膜移植是治療角膜盲最有效的手段。然而，由于供體材料的匱乏，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了角膜盲患者的需求。因此，尋找有效的角膜替代物用于角膜移植，是目前眼科界亟待解決的問題。早期的角膜替代物研究多集中于人工角膜(Keratoprosthesis)，有些已應(yīng)用于臨床，然而因生物相容性差、術(shù)后并發(fā)癥較多等原因，限制了其在臨床的

2、應(yīng)用。組織工程人工角膜是近年來研究熱點(diǎn)，由種子細(xì)胞和可降解支架材料經(jīng)體外構(gòu)建而成，可最大程度地模仿天然角膜結(jié)構(gòu)和功能。國內(nèi)外已有學(xué)者采用天然或人工合成材料進(jìn)行組織工程角膜構(gòu)建，取得了較大進(jìn)展，但因該構(gòu)建物機(jī)械力學(xué)性能不足以及光學(xué)特性不佳等原因僅能用于基礎(chǔ)研究。有報道證實(shí)，采用天然的材料如動物或人膠原制作支架可以增強(qiáng)其生物相容性。一些異種來源的細(xì)胞外基質(zhì)已成功用于構(gòu)建人工器官，如皮膚、心臟、血管等。我們課題組前期研究也證實(shí)，0.5％SDS

3、(Sodium Dodecyl Sulfate)處理的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(Acellular PorcineCornea Matrix，APCM)具有較好的透光性、力學(xué)性能、生物安全性及生物相容性，細(xì)胞及遺傳物質(zhì)被去除的同時，角膜的天然結(jié)構(gòu)得到了良好的保留。然而，APCM能否應(yīng)用于組織工程人工角膜構(gòu)建并用于移植是本研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。鑒于角膜板層移植是治療一些常見角膜病的有效手段，同時能夠避免角膜內(nèi)皮損傷和排斥，本研究主要開展了以異種脫細(xì)胞

4、角膜支架進(jìn)行組織工程兔角膜前板層構(gòu)建的研究，并成功進(jìn)行動物角膜板層移植，取得了較好的效果，目前國內(nèi)外尚無類似研究報道。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：兔角膜細(xì)胞的培養(yǎng)及APCM的制備。
　　 目的：探討應(yīng)用無血清培養(yǎng)基KSFM培養(yǎng)兔角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞的可行性，同時對脫細(xì)胞方法進(jìn)行改良以制備.APCM用于組織工程人工角膜前板層構(gòu)建。
　　 方法：⑴兔角膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下獲取新西蘭大白兔眼角膜，

5、仔細(xì)去除虹膜、結(jié)膜及多余鞏膜，解剖顯微鏡下撕下內(nèi)皮層用于組織塊培養(yǎng)；將去內(nèi)皮角膜組織置于2.4U/ml DispaseⅡ消化1h，獲取角膜上皮片，經(jīng)0.25％胰酶-0.02％EDTA獲取上皮細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)；剩余角膜基質(zhì)剪碎成1mm×1mm大小，置于0.5mg/ml膠原酶Ⅰ37℃消化過夜，獲取基質(zhì)細(xì)胞懸液。將3種細(xì)胞各分為2組，即KSFM培養(yǎng)組和含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)組，置于六孔板內(nèi)培養(yǎng)，每種細(xì)胞每組3個孔，各接種8個板，

6、觀察各培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計數(shù)法描記生長曲線；⑵APCM的制備及去細(xì)胞效果檢測：改良脫細(xì)胞制作方法，無菌條件下將處理后的新鮮豬角膜置于0.5％SDS溶液4℃振搖4h×6次，不含雙抗PBS沖洗2h×8次，含雙抗PBS沖洗1h×3～6次獲取無菌APCM，進(jìn)行以下檢測：1)H.E.及DAPI檢測脫細(xì)胞角膜基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞及遺傳物質(zhì)的殘留；2)MTT實(shí)驗(yàn)檢測材料浸提液對角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線的影響；3)電鏡觀察材料的結(jié)構(gòu)及有無細(xì)胞殘留

7、。
　　 結(jié)果：①KSFM組：培養(yǎng)2d，上皮細(xì)胞形成克隆團(tuán)，基質(zhì)細(xì)胞貼壁呈樹枝狀，內(nèi)皮細(xì)胞未見爬出；培養(yǎng)7d，上皮細(xì)胞緊密連接呈片狀(密度達(dá)到90％～100％)，基質(zhì)細(xì)胞呈樹枝狀(密度達(dá)70～80％)，內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密，形態(tài)不規(guī)則；傳代后，細(xì)胞生長緩慢或不生長，漂浮細(xì)胞較多；②含10％FBS的DMEM/F12組：培養(yǎng)2d，上皮細(xì)胞形成克隆團(tuán)，基質(zhì)細(xì)胞呈梭形，內(nèi)皮細(xì)胞可見有少量細(xì)胞爬出；培養(yǎng)5d，上皮呈鵝卵石樣已達(dá)60％密度，基質(zhì)

8、細(xì)胞呈梭形達(dá)70～80％密度，可見大量內(nèi)皮細(xì)胞從內(nèi)皮片組織周邊爬出，呈不規(guī)則狀；上皮和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)7d傳代，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)10d后傳代，生長狀態(tài)均良好，基質(zhì)細(xì)胞可傳10代。KSFM培養(yǎng)的上皮和基質(zhì)細(xì)胞的生長曲線與含血清培養(yǎng)基相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。③MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)APCM浸提液對角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線無影響(P>0.05)；H.E.及DAPI證實(shí)材料內(nèi)無細(xì)胞成分殘留；電鏡示材料結(jié)構(gòu)完整，膠原排列整齊。
　　

9、 結(jié)論：KSFM可用來培養(yǎng)角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞，但細(xì)胞生長較緩慢，易死亡；APCM經(jīng)改良的脫細(xì)胞方法處理效果良好，可用來進(jìn)行組織工程人工角膜構(gòu)建。
　　 第二部分：組織工程兔角膜前板層的體外構(gòu)建。
　　 目的：探討以APCM為支架體外構(gòu)建含角膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞的組織工程兔角膜前板層的可行性。
　　 方法：解剖顯微鏡下獲取含前彈力層的APCM薄片(厚約1～2mm、直徑7mm)，置于培養(yǎng)基內(nèi)37℃下浸泡24h，以備

10、接種細(xì)胞。胰酶消化獲取3代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞終濃度為5×105/ml，應(yīng)用lml胰島素空針平行于APCM前彈力層平面，將1ml基質(zhì)細(xì)胞懸液沿著材料邊緣接種于內(nèi)靜置培養(yǎng)24h，而后置于搖床上振搖培養(yǎng)7d；將1代角膜緣上皮細(xì)胞以5×103/mm2的密度接種于構(gòu)建物表面，等待2h待細(xì)胞貼附于材料表面后，輕輕添加培養(yǎng)基靜置再培養(yǎng)7d，構(gòu)建同時含角膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞的組織工程兔角膜前板層。將接種基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)8d后的構(gòu)建物再貼壁培養(yǎng)7d，觀

11、察有無細(xì)胞從角膜周邊爬出，間接鑒定構(gòu)建物內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞活性；分別于3d、8d、15d取材進(jìn)行H.E.染色，觀察構(gòu)建物細(xì)胞生長情況及組織結(jié)構(gòu)；免疫染色檢測角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CK3和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)；取15d構(gòu)建物標(biāo)本分別進(jìn)行免疫染色檢查和掃描電鏡觀察。兔角膜前板層的三維構(gòu)建過程均采用含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　 結(jié)果：構(gòu)建物再貼壁培養(yǎng)5d，可見有大量基質(zhì)細(xì)胞爬出，間接證實(shí)材料內(nèi)細(xì)胞活性。

12、H.E.染色示構(gòu)建物結(jié)構(gòu)完整，未見明顯的結(jié)構(gòu)改變，膠原纖維間隙較大；3d，可見基質(zhì)內(nèi)有細(xì)胞生長，密度分布不均勻，膠原排列較規(guī)則；8d，可見基質(zhì)內(nèi)生長大量細(xì)胞，密度較均勻，膠原纖維間隙較大，排列整齊；15d，材料內(nèi)仍分布大量細(xì)胞，表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin，密度較均勻，材料表面有2～3層細(xì)胞，表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK3，膠原排列整齊，纖維間隙較大。掃描電鏡示膠原纖維水腫膨脹明顯，部分區(qū)域見有膠原纖維斷裂，膠原排列較整齊，可見有梭形的

13、基質(zhì)細(xì)胞附著生長。經(jīng)過100％無菌甘油脫水，構(gòu)建物能夠恢復(fù)透明，表明APCM經(jīng)過細(xì)胞接種再培養(yǎng)過程，三維結(jié)構(gòu)保持良好。
　　 結(jié)論：APCM可用于組織工程人工角膜的構(gòu)建；構(gòu)建物具有正常兔角膜的表型，且脫水后能恢復(fù)透明，驗(yàn)證了該三維培養(yǎng)方法的可行性，為兔角膜全層和人角膜的構(gòu)建奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第三部分：組織工程兔角膜前板層的動物移植實(shí)驗(yàn)。
　　 目的：初步探討體外構(gòu)建的兔角膜前板層體內(nèi)移植后的生物學(xué)功能。

14、r>　　 方法：1.5～2 kg新西蘭大白兔20只隨機(jī)分為兩組，即構(gòu)建物移植組和APCM空支架組，每組10只，各組均以右眼做術(shù)眼，左眼做陰性對照。術(shù)前3d術(shù)眼滴用抗生素，3％戊巴比妥鈉(1ml/kg)經(jīng)耳緣靜脈進(jìn)行麻醉，含慶大霉素生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，制備6.5mm直徑大小角膜植床，采用國產(chǎn)10-0尼龍線對位縫合7mm直徑大小植片至植床(共16針)，并覆蓋羊膜，結(jié)膜下隔日注射慶大霉素及地塞米松，合并應(yīng)用典舒眼水(3次/天)，構(gòu)建物移植組

15、術(shù)后1個月拆線。分別于1d、3d、7d、14d、21d、28d觀察以下指標(biāo)：結(jié)膜充血、水腫、分泌物，角膜水腫、混濁、浸潤、新生血管、炎癥反應(yīng)，熒光素染色觀察角膜上皮的完整性；術(shù)后5周進(jìn)行活體共聚焦檢查；于1周、2周、4周取材經(jīng)4％多聚甲醛及3％戊二醛固定，分別進(jìn)行組織學(xué)檢查及掃描電鏡觀察。
　　 結(jié)果：⑴構(gòu)建物移植組：術(shù)后1周，羊膜脫落，結(jié)膜輕度充血水腫，角膜上皮已覆蓋大部分植片，未見有角膜新生血管，虹膜紋理可見，組織學(xué)檢查見植

16、片內(nèi)膠原排列規(guī)則整齊，有少量細(xì)胞分布，植片與植床邊界清晰，材料表面可見1～2層上皮細(xì)胞；術(shù)后2周，結(jié)膜輕度充血，中央角膜輕度混濁，未見有新生血管，植片表面有小部分區(qū)域上皮缺損，但可見虹膜紋理，組織學(xué)檢查見材料表面分布有類似正常角膜的上皮結(jié)構(gòu)，植片內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整，膠原排列規(guī)則整齊，有細(xì)胞分布；術(shù)后4周，結(jié)膜充血水腫加重，植片表面不光滑，但較透明，可見角膜新生血管分布在周邊區(qū)域，上皮已覆蓋大部分植片，虹膜紋理可見，組織學(xué)檢查同術(shù)后2周，掃描電

17、鏡示植片表面上皮排列與正常角膜已無明顯差異；術(shù)后5周(已拆線1周)，結(jié)膜充血水腫消失，植片區(qū)域角膜較透明，有輕微瘢痕形成，大部分新生血管已退去，虹膜紋理清晰，植片區(qū)域可見點(diǎn)狀熒光素著色，激光共聚焦顯示術(shù)眼角膜內(nèi)皮密度及形態(tài)均正常。⑵APCM空支架組：術(shù)后4周內(nèi)角結(jié)膜反應(yīng)情況相似于構(gòu)建物移植組，但上皮始終無法完全覆蓋植片表面，中央角膜呈現(xiàn)中度混濁狀態(tài)，但仍可透見虹膜。組織學(xué)檢查見植片膠原排列較規(guī)則，無明顯結(jié)構(gòu)改變，但與受體角膜分界明顯；植