利用脫細胞豬角膜基質(zhì)構建組織工程化兔板層角膜的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、角膜是位于眼表的透明組織,具有屏障外界刺激和屈光等重要功能,包括5層結構:復層角膜上皮,前彈力層,角膜基質(zhì)層,后彈力層,單層內(nèi)皮細胞。嚴重、持續(xù)的角膜損傷會造成角膜潰瘍,穿孔,瘢痕形成,最終影響視功能。目前角膜病已成為全球第二大致盲眼病。作為可逆性盲,角膜移植是治療角膜盲的主要手段。在我國,由于移植材料的來源匱乏,每年能夠進行的角膜移植手術遠遠不能滿足臨床幾百萬例的等待需求,組織工程化角膜是解決這一問題的有效途徑。
   目前組

2、織工程角膜的研究因所選用支架材料的不同,構建的角膜替代物有著不同的表現(xiàn)。以合成材料作為支架材料所構建的組織工程角膜,由于材料本身不能完全模擬天然細胞外基質(zhì)的結構和成分,往往在生物力學、光學性能以及生物學特性等方面存在不同程度的不足。而異種角膜是一種良好的角膜支架材料來源,本實驗室所開發(fā)的脫細胞豬角膜基質(zhì)(Acellular porcine cornea stroma,APCS)在前期研究證實其具有足夠的生物力學強度,高度的透明性;角膜基

3、質(zhì)天然結構和細胞外基質(zhì)成分的保留使其具有良好的生物學特性,能夠滿足組織工程角膜構建的要求。因此本課題:
   目的:
   利用自行研制的脫細胞豬角膜基質(zhì)作為支架材料,體外構建組織工程化的兔板層角膜。
   方法:
   1.制備角膜構建需要的支架材料,并對其進行HE染色以檢測脫細胞情況,利用蛋白多糖檢測試劑盒鑒定脫細胞豬角膜基質(zhì)中氨基葡聚糖的含量;并檢測脫細胞豬角膜基質(zhì)在2小時內(nèi)的吸水率。
  

4、 2.取新西蘭大白兔顳上象限角膜緣小組織塊,種植在經(jīng)表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)復水的脫細胞豬角膜基質(zhì)片上,使用自行研制的干燥裝置進行體外培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、2、3周取材時對構建的板層角膜表層細胞形態(tài)進行倒置相差顯微鏡的觀察,取到的板層角膜進行石蠟包埋后HE染色觀察板層角膜的組織結構;通過透射電鏡對板層角膜的復層上皮細胞間以及細胞與基質(zhì)問的連接情況進行檢查,免疫熒光染色檢測板層角膜基底膜組分纖維

5、連接蛋白和層粘連蛋白的形成情況。
   結果:
   1.對脫細胞豬角膜基質(zhì)進行HE染色結果顯示,經(jīng)過脫細胞處理的豬角膜墓質(zhì)中未見到任何完整細胞或細胞碎片,膠原板層結構未破壞。蛋白多糖定量分析,脫細胞豬角膜基質(zhì)較正常角膜在脫細胞過程中丟失了20%左右的氨基葡聚糖,但是在吸水率檢測中,2小時內(nèi)脫細胞豬角膜基質(zhì)仍可恢復至正常含水量。
   2.使用角膜緣小組織塊構建正常含水量板層角膜。倒置相差顯微鏡下可見到其表層上皮

6、細胞在培養(yǎng)過程中呈典型的“鋪路石”樣外觀。組織學及超微結構均顯示角膜上皮細胞在支架材料上能夠良好黏附,生長,增殖,遷移并分化,所形成的復層結構類似于天然角膜上皮細胞的極性分布;同時,透射電鏡結果顯示細胞——細胞問和細胞——細胞外基質(zhì)間連接形成,可見到成熟的緊密連接,半橋粒等結構。免疫熒光顯示構建的板層角膜,基底膜組分纖維連接蛋白和層粘連蛋白的表達陽性。
   結論:
   以脫細胞豬角膜基質(zhì)為支架材料所構建的兔板層角膜,

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