脫細(xì)胞角膜基質(zhì)聯(lián)合內(nèi)皮樣細(xì)胞構(gòu)建生物工程角膜后板層的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、角膜病致盲率位居全球第二，同時(shí)它也是國內(nèi)第二大致盲眼病。同種異體角膜移植是目前治療不可逆性角膜盲最有效的方法，但角膜供體來源的極度匱乏使其應(yīng)用受到了限制。生物工程角膜材料來源豐富，生物相容性好，因此能夠有效地緩解天然角膜極其匱乏的壓力，社會(huì)意義重大，經(jīng)濟(jì)效益顯著。
　　 生物工程角膜的構(gòu)建是將體外擴(kuò)增的種子細(xì)胞（包括角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）種植于支架材料上，經(jīng)過體外三維培養(yǎng)形成與天然角膜在結(jié)構(gòu)和功能上相似的角膜植片替代

2、物。支架材料和種子細(xì)胞是兩大關(guān)鍵要素，也是目前生物工程角膜研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　 目前大部分支架材料因生物相容性、透明度或機(jī)械強(qiáng)度的不足而僅限于組織學(xué)、生理、病理、毒理、藥理及角膜損傷等方面的基礎(chǔ)研究。我們課題組前期研制的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(acellularporcinecornealmatrix，APCM)，所含異種細(xì)胞及遺傳物質(zhì)被完全脫除，其天然膠原排列結(jié)構(gòu)得到了的保留，具有良好的透光性、機(jī)械力學(xué)性能以及生物相容性，并已成

3、功應(yīng)用于兔角膜前板層的構(gòu)建。但是APCM是否能夠支持角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生長并且形成功能性的角膜內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，仍是目前研究的空白。生物工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建可為角膜內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)性的基礎(chǔ)研究提供良好的體外模型，也可為今后全層生物工程角膜的研制奠定技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)還可成為臨床上單純角膜內(nèi)皮移植手術(shù)潛在的供體植片來源，具有較高的研究價(jià)值和意義。
　　 生物工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建需要充足的內(nèi)皮細(xì)胞供給，人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞缺乏增殖能力，難以在體外大量擴(kuò)增培養(yǎng)，

4、因此尋找新的內(nèi)皮細(xì)胞來源成為亟待解決的問題。目前由于尚未找到理想的內(nèi)皮細(xì)胞來源，大部分有關(guān)生物工程角膜內(nèi)皮構(gòu)建的研究都是利用增殖能力相對(duì)較強(qiáng)的低等動(dòng)物的角膜內(nèi)皮細(xì)胞或永生化人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系等，此類生物工程角膜內(nèi)皮可用于體外實(shí)驗(yàn)研究，但是尚難以滿足臨床應(yīng)用的要求。神經(jīng)嵴干細(xì)胞是角膜內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，其來源充足（可在體外由胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來），如能將其誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮細(xì)胞，將為生物工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建提供新的內(nèi)皮細(xì)胞來源。
　　

5、 鑒于以上問題，本研究首先以后板層APCM為支架，探討了其與人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的生物相容性，證實(shí)后板層APCM支架可支持人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系B4G12的生長，并形成具備一定泵功能的生物工程角膜內(nèi)皮，可作為良好的人角膜內(nèi)皮體外模型而應(yīng)用于基礎(chǔ)研究;其次，本研究探討了將大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮細(xì)胞的可行性，篩選出成功的誘導(dǎo)方案，獲得了在形態(tài)和功能上接近正常角膜內(nèi)皮細(xì)胞的角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞;最后，我們利用后板層APCM支架、角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞及原

6、代培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建了無上皮生物工程角膜，并初步嘗試進(jìn)行動(dòng)物穿透性角膜移植實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示術(shù)后植片上皮可自我修復(fù)，并且植片具備一定的內(nèi)皮泵功能，病理染色顯示植片基質(zhì)內(nèi)有大量炎細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤，提示出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，今后在植片的構(gòu)建方法、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及手術(shù)操作方法等方面尚需改善。
　　 第一部分，利用后板層APCM支架和人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系構(gòu)建角膜內(nèi)皮體外模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討以后板層APCM為支架，以人角膜內(nèi)皮細(xì)

7、胞系為種子細(xì)胞構(gòu)建角膜內(nèi)皮體外模型的可行性。
　　 方法：1.后板層APCM支架的制備:無菌條件下板層分離新鮮豬角膜，留取約1/2厚度的后板層組織，用含有1％青霉素-鏈霉素的磷酸鹽緩沖液充分洗滌后將其置于0.5％無菌SDS溶液中于4℃條件下脫細(xì)胞24小時(shí)。隨后用無菌磷酸鹽緩沖液充分漂洗脫細(xì)胞后的組織，于-20℃條件下凍干12小時(shí)，生物安全柜內(nèi)自然風(fēng)干3小時(shí)，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.后板層APCM支架的形態(tài)和細(xì)胞毒性

8、檢測:HE染色檢測后板層APCM中細(xì)胞脫除情況，MTT法檢測后板層APCM浸提液對(duì)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞系增殖活性的影響。
　　 3.人角膜內(nèi)皮細(xì)胞B4G12的培養(yǎng):用層粘連蛋白與硫酸軟骨素混合液包被培養(yǎng)瓶底壁，于常規(guī)條件下用含有人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子的人內(nèi)皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)B4G12細(xì)胞，0.05％胰酶-0.02％EDTA常規(guī)消化傳代。
　　 4.生物工程角膜內(nèi)皮的構(gòu)建:解剖顯微鏡下切取直徑約為8mm、厚度約為1mm

9、的后板層APCM，將其置于B4G12細(xì)胞培養(yǎng)基中于37℃浸泡24小時(shí)后，后彈力層面向上將其置于24孔板內(nèi)，自然風(fēng)干表面。調(diào)整B4G12細(xì)胞接種密度為2000個(gè)/mm2，將細(xì)胞懸液輕輕滴于APCM后彈力層面，待細(xì)胞貼附后補(bǔ)足培養(yǎng)基至整個(gè)APCM支架上表面被浸沒。對(duì)所構(gòu)建生物工程角膜內(nèi)皮進(jìn)行掃描電鏡檢測，臺(tái)盼藍(lán)-茜素紅S雙染色、HE染色、免疫熒光染色檢測閉鎖小帶蛋白-1(zonulaoccluden-1，ZO-1)、Na+/K+ATP酶的表

10、達(dá)情況以及角膜腫脹實(shí)驗(yàn)檢測內(nèi)皮泵功能。
　　 結(jié)果：HE染色顯示后板層APCM支架中細(xì)胞及遺傳物質(zhì)成分被完全去除，膠原排列結(jié)構(gòu)及后彈力層保留完好。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)后板層APCM浸提液對(duì)B4G12細(xì)胞生長曲線無影響(P＞0.05)。B4G12細(xì)胞種植于后板層APCM支架后，臺(tái)盼藍(lán)-茜素紅S雙染色顯示多邊形細(xì)胞相互之間連接緊密，形成完整的單細(xì)胞層覆蓋APCM后彈力層面，平均細(xì)胞密度為2061±344個(gè)/mm2。HE和DAPI染色證

11、實(shí)僅在APCM后彈力層面有單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而APCM基質(zhì)中不含有任何細(xì)胞及其核物質(zhì)。免疫熒光染色顯示B4G12細(xì)胞在APCM支架上表達(dá)功能相關(guān)性蛋白ZO-1和Na+/K+ATP酶。角膜腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Na+/K+ATP酶抑制劑烏巴因可誘發(fā)角膜基質(zhì)水腫，使得角膜基質(zhì)厚度增加51.7％，而不含烏巴因組僅產(chǎn)生可逆性的角膜基質(zhì)水腫，從而間接證明所構(gòu)建生物工程角膜具有一定的泵功能。
　　 結(jié)論：利用后板層APCM支架和B4G12構(gòu)建的生物工

12、程角膜內(nèi)皮具備與天然角膜內(nèi)皮類似的結(jié)構(gòu)與功能，可作為內(nèi)皮相關(guān)性研究良好的體外模型。
　　 第二部分：大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討體外誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞分化為功能性角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的可行性。
　　 方法：1.大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定:取9天孕齡大鼠胚胎，從背側(cè)暴露神經(jīng)管，用細(xì)針頭挑取前十個(gè)體節(jié)的神經(jīng)管組織，將其置于事先由纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，48小時(shí)后去

13、除神經(jīng)管組織，繼續(xù)培養(yǎng)已遷移出的神經(jīng)嵴干細(xì)胞，0.05％胰酶-0.02％EDTA常規(guī)消化傳代;免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)記物P75和HNK-1的表達(dá)。
　　 2.大鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng):取新鮮大鼠角膜，充分漂洗后浸泡于培養(yǎng)基中于37℃過夜孵育以穩(wěn)定細(xì)胞活性;次日將浸泡有大鼠角膜的培養(yǎng)基離心，棄上清后加入0.02％EDTA，于37℃條件下消化1小時(shí)，輕輕吹打角膜以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞從后彈力層脫落;吹打完畢后離心棄上清，用內(nèi)皮細(xì)胞

14、培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀，常規(guī)條件下培養(yǎng)。
　　 3.條件培養(yǎng)基的配制:待大鼠角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長至70％-90％滿時(shí)，每12小時(shí)提取一次細(xì)胞培養(yǎng)上清液，過濾后-80℃保存;將內(nèi)皮細(xì)胞上清液與神經(jīng)嵴干細(xì)胞培養(yǎng)基分別按照1∶3，1∶1和3∶1的比例混合，得到內(nèi)皮細(xì)胞上清液濃度分別為25％、50％和75％的條件培養(yǎng)基。
　　 4.神經(jīng)嵴干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及角膜內(nèi)皮分化標(biāo)記物的鑒定:
　　 分別用條件培養(yǎng)基法及細(xì)胞共培養(yǎng)法誘導(dǎo)

15、培養(yǎng)大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞，每日觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化，初步篩選出使神經(jīng)嵴干細(xì)胞向角膜內(nèi)皮細(xì)胞分化的方案后，對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行角膜內(nèi)皮細(xì)胞分化標(biāo)記物的鑒定，具體實(shí)驗(yàn)分組如下:
　　 1)條件培養(yǎng)基法:
　　 A:細(xì)胞外基質(zhì)包被組:用層粘連蛋白和硫酸軟骨素包被6孔板底壁，分別用25％，50％和75％的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)神經(jīng)嵴干細(xì)胞;
　　 B:無包被對(duì)照組:對(duì)6孔板底壁不進(jìn)行包被，分別用25％，50％和75％的條件

16、培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)神經(jīng)嵴干細(xì)胞;
　　 2)細(xì)胞共培養(yǎng)法:
　　 A:細(xì)胞外基質(zhì)包被組:用層粘連蛋白和硫酸軟骨素包被Transwell小室聚碳酸酯膜的上室面，將大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞與角膜內(nèi)皮細(xì)胞按照1∶1，1∶5，1∶10及1∶20的數(shù)量比分別接種于Transwell小室的上室和下室內(nèi)，進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo);
　　 B:無包被對(duì)照組:不對(duì)Transwell小室聚碳酸酯膜進(jìn)行包被，將大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞與角膜內(nèi)皮細(xì)胞按照1∶1，1∶

17、5，1∶10及1∶20的數(shù)量比分別接種于Transwell小室的上室和下室內(nèi)，進(jìn)行共培養(yǎng)誘導(dǎo);
　　 收集有陽性變化的誘導(dǎo)細(xì)胞，利用免疫熒光法檢測誘導(dǎo)細(xì)胞角膜內(nèi)皮細(xì)胞分化標(biāo)記物N型鈣粘素、ZO-1和Na+/K+ATP酶的表達(dá);利用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測細(xì)胞誘導(dǎo)分化率;利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtime-polymerasechainreaction,RT-PCR)檢測角膜內(nèi)皮分化相關(guān)基因FoxC1和Pitx2的表達(dá)。

18、r>　　 5.角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞動(dòng)物移植:用液氮冷凍法制造角膜內(nèi)皮功能不全大鼠模型，將角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并用熒光染料標(biāo)記后，調(diào)整細(xì)胞接種密度為3000個(gè)/mm2，利用前房注射的方法將角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞移植于術(shù)眼角膜的后彈力層面，以空白模型為對(duì)照組，術(shù)后定期進(jìn)行裂隙燈觀察、激光共聚焦角膜顯微鏡觀察以及標(biāo)本的組織學(xué)染色，評(píng)價(jià)角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞的體內(nèi)功能和生物安全性。
　　 結(jié)果：神經(jīng)管貼壁48小時(shí)后可見有纖維樣細(xì)胞從其周圍遷移出，免疫

19、熒光檢測顯示這些細(xì)胞同時(shí)表達(dá)神經(jīng)嵴干細(xì)胞標(biāo)記物P75和HNK-1，證實(shí)其為神經(jīng)嵴干細(xì)胞。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞外基質(zhì)包被聯(lián)合75％條件培養(yǎng)基+10％胎牛血清誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后，神經(jīng)嵴干細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)變化，小部分細(xì)胞由纖維樣轉(zhuǎn)變?yōu)槎噙呅危?周后約有40％-50％的細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，繼續(xù)延長誘導(dǎo)時(shí)間不能增加多邊形細(xì)胞的比例。免疫熒光檢測證實(shí)所得多邊形細(xì)胞表達(dá)角膜內(nèi)皮分化標(biāo)記物N型鈣粘素;經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，N鈣粘素陽性的細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)的40％-5

20、0％，與鏡下觀察結(jié)果一致。RT-PCR結(jié)果證實(shí)多邊形細(xì)胞表達(dá)角膜內(nèi)皮分化相關(guān)基因FoxC1和Pitx2。角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞動(dòng)物移植術(shù)后手術(shù)組大鼠角膜逐漸恢復(fù)透明，水腫逐漸減輕，1個(gè)月后角膜可恢復(fù)正常透明度和厚度，而對(duì)照組大鼠角膜持續(xù)水腫混濁。激光共聚焦角膜顯微鏡觀察可見手術(shù)組大鼠角膜后彈力層被多邊形細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞密度約為2872.6±172.7個(gè)/mm2，而對(duì)照組大鼠角膜后彈力層未見有細(xì)胞覆蓋。手術(shù)組大鼠角膜HE染色顯示其后彈力層有單細(xì)胞層

21、貼附，內(nèi)皮面在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，證實(shí)該單細(xì)胞層為角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞，術(shù)眼角膜內(nèi)未見有異常新生物或炎細(xì)胞樣細(xì)胞浸潤，對(duì)照組大鼠角膜HE染色顯示其后彈力層面無細(xì)胞附著，熒光顯微鏡下無熒光信號(hào)。
　　 結(jié)論：利用條件培養(yǎng)基法可將大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為功能性角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞。
　　 第三部分：構(gòu)建無上皮生物工程角膜及其動(dòng)物移植的初步實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討利用后板層APCM支架、角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞及角膜基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建無

22、上皮生物工程角膜的可行性及其動(dòng)物移植效果評(píng)價(jià)。
　　 方法：1.同前法制備后板層APCM支架，利用條件培養(yǎng)基法誘導(dǎo)培養(yǎng)角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞。
　　 2.兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng):取新鮮兔角膜，在解剖顯微鏡下撕去后彈力層，然后將角膜剪成小塊，用膠原酶消化后去除上皮層，將殘留基質(zhì)碎塊貼壁培養(yǎng)，待基質(zhì)細(xì)胞遷移出后移除基質(zhì)塊，繼續(xù)培養(yǎng)遷移出的基質(zhì)細(xì)胞，常規(guī)消化傳代。
　　 3.無上皮生物工程角膜的構(gòu)建及兔穿透性角膜移植實(shí)驗(yàn):將

23、基質(zhì)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分別從8個(gè)方向?qū)⑵溆靡葝u素針注射入制備好的后板層APCM支架中，常規(guī)條件下培養(yǎng)并逐步增加角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞培養(yǎng)基的比例，逐步馴化基質(zhì)細(xì)胞使其適應(yīng)角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，馴化完成后將角膜內(nèi)皮樣細(xì)胞種植于后板層APCM支架的后彈力層面，常規(guī)培養(yǎng)2周后行兔穿透性角膜移植實(shí)驗(yàn)，以后板層APCM空支架為對(duì)照，用羊膜覆蓋植片表面，術(shù)后每日典必殊眼水點(diǎn)眼4次，典必殊眼膏1次，裂隙燈定期觀察，并取材行病理檢查。
　　 結(jié)果：術(shù)

24、后1周術(shù)眼結(jié)膜充血，分泌物較多，羊膜溶解并自然脫落，生物工程角膜植片及APCM空支架植片水均明顯水腫，熒光素染色顯示生物工程角膜植片約70％區(qū)域的上皮已修復(fù)，而APCM空支架植片上皮修復(fù)緩慢且表面不光滑。術(shù)后2周炎癥反應(yīng)略有減輕，生物工程角膜植片水腫有所消退，有溶解跡象，熒光素染色顯示植片上皮已基本修復(fù)，APCM空支架植片水腫程度較為嚴(yán)重，上皮層基本修復(fù)，但是表面欠光滑。角膜標(biāo)本HE染色可見生物工程角膜植片基質(zhì)內(nèi)有大量炎細(xì)胞樣細(xì)胞，膠原