人胚胎干細胞誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細胞的實驗研究.pdf

1、角膜病患病率高、致盲性強，位居全球致盲原因第二位，目前，全球約有超過1000萬的角膜盲患者;同時，角膜病也是我國第二大致盲性眼病，調(diào)查顯示，我國現(xiàn)有角膜盲患者約100多萬。迄今為止，同種異體角膜移植是治療不可逆性角膜盲最有效的方法。然而，角膜供體的極度匱乏使其應(yīng)用受到了限制，遠遠滿足不了角膜盲患者的需求;我國每年約有30萬患者需行角膜移植術(shù)，但因供體角膜有限，每年施行移植手術(shù)的患者尚不足4000例(1.3％)。因此，尋找有效的角膜替代物

2、用于角膜移植一直是眼科界研究的熱點。目前人工角膜(Keratoprosthesis)是唯一被批準(zhǔn)用于臨床的角膜替代物，但其生物相容性差、術(shù)后并發(fā)癥多，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。
　　組織工程角膜是近年來研究的熱點。其材料來源豐富、生物相容性好，可最大程度的模擬天然角膜結(jié)構(gòu)和功能，有望替代天然角膜用于角膜移植，緩解角膜供體極其匱乏的壓力。因此，組織工程角膜的研究具有重大社會意義及顯著經(jīng)濟效益。組織工程角膜是通過將種子細胞（角膜上皮細

3、胞、基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞）接種子支架材料，經(jīng)過體外三維培養(yǎng)構(gòu)建而成。種子細胞和支架材料是組織工程角膜構(gòu)建的兩大關(guān)鍵要素。我們課題組前期研制的脫細胞豬角膜基質(zhì)(acellular porcine corneal matrix，APCM)，其中的異種細胞及遺傳物質(zhì)被完全脫除，同時膠原及其天然排列結(jié)構(gòu)得到了保留，從而具有良好的透光性、生物相容性以及機械力學(xué)性能;組織工程角膜前、后板層的成功構(gòu)建充分證實APCM是組織工程角膜構(gòu)建的良好支架材料。種

4、子細胞必須具備較強的增殖能力，能在體外大量擴增。人角膜基質(zhì)細胞在體外有較強的增殖能力，而上皮細胞和內(nèi)皮細胞增殖能力有限，尤其是內(nèi)皮細胞，幾乎沒有增殖能力，難以在體外培養(yǎng)、擴增，因此尋找新的內(nèi)皮細胞來源成為亟待解決的問題。目前由于尚未找到理想的內(nèi)皮細胞來源，大部分有關(guān)組織工程角膜構(gòu)建的研究都是利用增殖能力相對較強的低等動物的角膜內(nèi)皮細胞或永生化人角膜內(nèi)皮細胞系等作為內(nèi)皮細胞的種子細胞，此類內(nèi)皮細胞構(gòu)建的組織工程角膜可用于體外實驗研究，但是

5、難以滿足臨床應(yīng)用的要求。
　　胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)因其所具有的強大增殖能力和分化全能性可作為一種良好的種子細胞來源，為組織工程器官構(gòu)建提供無限的細胞供給。目前已有人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)誘導(dǎo)分化為心肌細胞、平滑肌細胞、多巴胺神經(jīng)元及運動神經(jīng)元等體細胞的報道。然而，迄今為止，國內(nèi)外尚無hESCs誘導(dǎo)分化成角膜內(nèi)皮細胞的研究報道。因此如

6、能實現(xiàn)hESCs向角膜內(nèi)皮細胞的誘導(dǎo)分化，這將為組織工程角膜的構(gòu)建提供理想的種子細胞來源。
　　因此，本研究探討了將hESCs定向誘導(dǎo)分化為角膜內(nèi)皮樣細胞(corneal endothelial cell-like cells，CEC-like cells)的可行性，獲得了在形態(tài)和功能上接近正常角膜內(nèi)皮細胞的CEC-like cells;將CEC-like cells接種于后板層脫細胞豬角膜支架(posterior acellul

7、ar porcine corneal matrix，PAPCM)后彈力層表面構(gòu)建組織工程角膜內(nèi)皮植片，體內(nèi)、體外實驗證實構(gòu)建物具有天然角膜后板層的形態(tài)和功能。
　　[目的]角膜脫水狀態(tài)和透明性的維持很大程度上依賴于角膜內(nèi)皮細胞的屏障及泵功能。人角膜內(nèi)皮細胞在體內(nèi)沒有增殖能力，體外培養(yǎng)條件下增殖能力也極其有限。因此，獲取大量具有正常角膜內(nèi)皮細胞功能的細胞有利于角膜內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)研究和角膜內(nèi)皮功能失代償?shù)闹委煛１狙芯刻接戵w外誘導(dǎo)人胚胎干

8、細胞經(jīng)眼周間充質(zhì)干細胞分化為角膜內(nèi)皮樣細胞的可行性。
　　[方法]通過Transwell共培養(yǎng)體系，將人胚胎干細胞與正在向成纖維細胞轉(zhuǎn)化的人角膜基質(zhì)細胞共培養(yǎng)5天，分化為眼周間充質(zhì)干細胞;改為人晶狀體上皮細胞源性條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)已向眼周間充質(zhì)干細胞分化的人胚胎干細胞14天，使其進一步分化為角膜內(nèi)皮樣細胞。利用免疫熒光法檢測誘導(dǎo)細胞眼周間充質(zhì)干細胞標(biāo)記物CD73和FOXC1以及角膜內(nèi)皮細胞分化標(biāo)記物N型鈣粘素、FOXC1、PITX

9、2、Na+/K+ATP酶和閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1，ZO-1)的表達。流式細胞儀分選CD73表達陽性的眼周間充質(zhì)干細胞;N型鈣粘素/Vimentin雙陽性的角膜內(nèi)皮樣細胞。為進一步證明人胚胎干細胞向角膜內(nèi)皮細胞分化，對分選出的眼周間充質(zhì)干細胞和角膜內(nèi)皮樣細胞行免疫印跡（Western blotting）和實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-polymerase chain reaction，RT-PC

10、R)檢測，評估Na+/K+ATP酶在這兩種細胞內(nèi)的表達情況。分選出的角膜內(nèi)皮樣細胞在體外傳代培養(yǎng)，擴增后，行免疫熒光檢測Na+/K+ATP酶、ZO-1、N型鈣粘素及Vimentin表達情況;擴增的角膜內(nèi)皮細胞經(jīng)羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein Diacetate Sueeinimidyl Ester,CFDASE)標(biāo)記后，接種于脫細胞豬角膜基質(zhì)后板層構(gòu)建角膜內(nèi)皮植片。角膜內(nèi)皮植片泵功能通過體外尤氏灌流系統(tǒng)及體

11、內(nèi)動物移植實驗進行評估。實驗動物術(shù)后觀察2月，定期行裂隙燈顯微鏡檢查照相、角膜內(nèi)皮鏡、激光共聚焦顯微鏡及取材病理切片HE染色等檢查。
　　[結(jié)果]人胚胎干細胞與分化的人角膜基質(zhì)細胞共培養(yǎng)5天，可見大量梭形細胞從貼壁的擬胚體爬出，表達眼周間充質(zhì)干細胞標(biāo)記物CD73和FOXC1;更換為人晶狀體上皮細胞源性條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天，可見眼周間充質(zhì)干細胞由梭形逐漸變?yōu)槎噙呅?，表達人角膜內(nèi)皮細胞標(biāo)記物N型鈣粘素、FOXC1、PITX2、Na+

12、/K+ATP酶和ZO-1。流式細胞儀成功分選出CD73表達陽性的眼周間充質(zhì)干細胞及N型鈣粘素/Vimentin雙陽性的角膜內(nèi)皮樣細胞。Western blotting和實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測表明角膜內(nèi)皮樣細胞較眼周間充質(zhì)干細胞Na+/K+ATP酶表達明顯上調(diào)。角膜內(nèi)皮樣細胞在體外傳代培養(yǎng)2代，擴增后的細胞Na+/K+ATP酶、ZO-1、N型鈣粘素

13、及Vimentin表達陽性。擴增的角膜內(nèi)皮樣細胞經(jīng)CFDASE標(biāo)記后，熒光顯微鏡下見綠色熒光，接種于脫細胞角膜基質(zhì)后板層成功構(gòu)建角膜內(nèi)皮植片。構(gòu)建物具有正常人角膜后板層類似的形態(tài)結(jié)構(gòu);尤氏灌流系統(tǒng)檢測內(nèi)皮泵功能參數(shù)，角膜內(nèi)皮植片與正常人角膜泵功能參數(shù)接近;將構(gòu)建的角膜內(nèi)皮植片移植到角膜內(nèi)皮功能失代償兔動物模型眼內(nèi)（實驗組），角膜逐漸恢復(fù)透明，而單純移植脫細胞角膜基質(zhì)后板層的兔眼角膜水腫混濁持續(xù)加重（對照組）。角膜內(nèi)皮鏡檢查見實驗組角膜后