人胚胎干細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化為功能性肝臟細(xì)胞的研究.pdf

1、肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌、先天性代謝性肝病等難治性、終末期肝病的治療一直都是醫(yī)療界棘手問(wèn)題。對(duì)于各種急、慢性肝功能衰竭，原位肝臟移植是一種較為有效的手段，但是有限的供肝來(lái)源卻制約著肝臟移植普遍開(kāi)展。肝細(xì)胞移植有可能成為治療上述疾病的替代或輔助治療方法，但由于肝細(xì)胞來(lái)源短缺、增殖困難等也限制了肝細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用。而近年來(lái)隨著干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)人們開(kāi)始探索怎樣利用胚胎干細(xì)胞來(lái)向肝細(xì)胞分化，這樣為臨床細(xì)胞替代治療提供合適的細(xì)胞來(lái)源提供了一個(gè)良好的

2、新思路，而且在藥物評(píng)估和肝臟發(fā)育分化等基礎(chǔ)研究方面也可發(fā)揮重要的作用。
　　 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES細(xì)胞)是來(lái)源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的一種高度未分化細(xì)胞，具有無(wú)限增殖和發(fā)育全能性等特點(diǎn)，可自發(fā)分化為多種細(xì)胞類型，如定向分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。在非肝源性干細(xì)胞研究領(lǐng)域，自2001年Hamazaki等[1]首次報(bào)道誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為肝臟細(xì)胞以來(lái)，ES源性肝臟細(xì)胞的體外研

3、究迅速開(kāi)展起來(lái)，但至今仍沒(méi)有建立一個(gè)高效安全的誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系。
　　 本課題擬運(yùn)用體外直接誘導(dǎo)方法，探討表觀遺傳修飾聯(lián)合多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為功能性肝臟細(xì)胞可行性，試圖建立起有效的誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系。
　　 人胚胎干細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化為功能性肝臟細(xì)胞
　　 目的:
　　 運(yùn)用直接誘導(dǎo)的方法，探討表觀遺傳修飾聯(lián)合多種細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為功能

4、性肝臟樣細(xì)胞的可行性，試圖建立有效的誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系。
　　 方法:
　　 用RT-PCR檢測(cè)pou5f1基因的表達(dá)鑒定H9人胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES細(xì)胞)的未分化特性，然后常規(guī)培養(yǎng)增殖ES細(xì)胞。誘導(dǎo)開(kāi)始：傳代ES細(xì)胞消化成細(xì)胞團(tuán)塊懸液后以1×104的密度種入鋪有基質(zhì)膠的6孔板中，加誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)(見(jiàn)表一)，整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程持續(xù)十七天。分化過(guò)程中用光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞

5、密度及形態(tài)學(xué)改變；RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞特異性基因白蛋白(albumin，ALB)、甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、α1抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白(transthyretin，TTR)、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tyrosine aminotransferase，TAT)、肝細(xì)胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor4α，HNF4α)、肝細(xì)胞核因子3β(hep

6、atocyte nuclear factor3β，HNF3β)、膽固醇7α-羥化酶A1(Cholesterol7α-hydroxylaseA1，CYP7A1)、細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin18，CK18)、細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)，的mRNA表達(dá)；免疫熒光化學(xué)檢測(cè)肝細(xì)胞特異性的蛋白AFP、ALB、CYP7A1、FVⅢ、FIX的表達(dá)。最后通過(guò)糖原染色試驗(yàn)和吲哚氰綠攝取試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)經(jīng)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是否具

7、有肝臟細(xì)胞特異性的功能。表一：細(xì)胞誘導(dǎo)流程圖(所加誘導(dǎo)因子及誘導(dǎo)時(shí)間)(圖表略：)注所用的試劑濃度分別為：Activin A(激活素A)100ng/ml、 SB(丁酸鈉)2.5mmol/L、BMP-4(骨形成蛋白4)10ng/ml、HGF(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)10ng/ml、OSM(致瘤素M)10ng/ml、Dex(地塞米松)10-7M、DMSO(二甲基亞砜)0.5％
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果：
　　 1

8、.1光鏡結(jié)果：
　　 1.1.1細(xì)胞密度：
　　 以1×104的密度種入鋪有基質(zhì)膠的6孔板中，以小鼠成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液(CM)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)來(lái)培養(yǎng)hESC，第二天觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開(kāi)始以小克隆的形式貼壁，到第四天克隆慢慢增殖達(dá)70％-80％富集時(shí)，培養(yǎng)液換為誘導(dǎo)培養(yǎng)液。誘導(dǎo)第一天到三天，培養(yǎng)板中出現(xiàn)大量漂浮的死細(xì)胞。第四到九天，存活下來(lái)的形態(tài)成卵圓形的細(xì)胞開(kāi)始向四周蔓延和增殖。第十到十一天，細(xì)胞繼續(xù)增殖

9、且形態(tài)趨于均一。誘導(dǎo)最后六天，細(xì)胞有少量死亡和老化的現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)十七天誘導(dǎo)后，培養(yǎng)板中細(xì)胞主要以鋪路石樣形態(tài)的肝臟細(xì)胞鋪于整個(gè)培養(yǎng)板的孔中。
　　 1.1.2細(xì)胞形態(tài)：
　　 以CM加bFGF培養(yǎng)四天以后，誘導(dǎo)開(kāi)始，撤除bFGF，加上誘導(dǎo)液。實(shí)驗(yàn)初期，實(shí)驗(yàn)組的變化主要是死細(xì)胞增多，原克隆變薄，立體感變?nèi)?，?xì)胞形態(tài)無(wú)多大變化。誘導(dǎo)中期，克隆繼續(xù)變薄并向周邊分化，分化的細(xì)胞逐漸由圓形或類圓形轉(zhuǎn)變成多角形。到誘導(dǎo)末期實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)有

10、鋪路石狀排列緊密的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，但細(xì)胞也有空泡樣變，折光率下降等。
　　 1.2 RT-PCR結(jié)果：
　　 經(jīng)過(guò)17天的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的細(xì)胞能夠不同程度地表達(dá)標(biāo)志肝臟細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的ALB、AFP、TTR、AAT、TAT、HNF-3β、HNF-4α、CYP7A1、CK18、CK19的mRNA。(附圖)
　　 1.3免疫熒光化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：
　　 誘導(dǎo)分化的細(xì)胞中有部分細(xì)胞ALB、AFP、CYP7A1、FVⅢ、FI