小分子化合物誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為角膜上皮樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:人干細(xì)胞因有強(qiáng)大的自我更新能力和多向分化潛能，利用小分子化合物調(diào)節(jié)效應(yīng)迅速可逆的特點(diǎn)，從小分子化合物促進(jìn)胚胎干細(xì)胞存活、自我更新及分化發(fā)育等方面入手，深入了解其對(duì)胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，以此探討在體外將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜上皮樣細(xì)胞的方法，進(jìn)一步揭示在誘導(dǎo)過(guò)程中相應(yīng)的分子機(jī)制。本課題設(shè)計(jì)了兩組小分子化合物組合作為不同的誘導(dǎo)方式，通過(guò)不同的檢測(cè)方法證實(shí)誘導(dǎo)生成的細(xì)胞為角膜上皮樣細(xì)胞，為角膜細(xì)胞移植治療獲得無(wú)限制角膜上皮來(lái)源，減少臨

2、床對(duì)受限于角膜供體的角膜移植手術(shù)需求，使更多患者獲得有效和及時(shí)治療提供參考途徑。
　　方法:人胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)至融合度到達(dá)80％以上消化，使用Aggrewell孔板培養(yǎng)法獲得擬胚體(Embryonic bodies，EBs)，在不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下加入小分子化合物誘導(dǎo)在體外可以分化為各種類(lèi)型細(xì)胞的擬胚體向外胚層、角膜上皮祖細(xì)胞及角膜上皮細(xì)胞方向分化。擬胚體在低粘附六孔板中誘導(dǎo)培養(yǎng)4天后貼壁培養(yǎng)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，觀察從擬胚

3、體爬出的細(xì)胞的形態(tài)，留取誘導(dǎo)第10天、20天、30天的細(xì)胞行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，提取RNA和蛋白質(zhì)，從DNA和蛋白水平檢測(cè)胚胎干細(xì)胞多能性基因OCT4、PAX6;角膜上皮祖細(xì)胞表面標(biāo)記物K15和角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記物K12、K3表達(dá)水平。探索不同小分子和不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合誘導(dǎo)特點(diǎn)及分化效率，尋求最優(yōu)誘導(dǎo)效率方式。
　　結(jié)果:1.小分子化合物IWP-2、SB505124和DAPT不同組合可在體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為角膜上皮樣細(xì)胞;2.隨

4、著誘導(dǎo)時(shí)間增加，小分子化合物誘導(dǎo)組細(xì)胞胚胎干細(xì)胞多能性基因的表達(dá)逐漸下調(diào)而角膜上皮祖細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)逐漸上調(diào);3.SHEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化作用下IWP-2、SB505124組合在第20天角膜上皮標(biāo)記物K3、K12的表達(dá)量最大。UM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化作用下IWP-2、SB505124組合和IWP-2、SB505124、DAPT組合在第20天誘導(dǎo)分化效率最高。DKSFM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化作用下IWP-2、SB505124、DAPT組

5、合在第30天誘導(dǎo)分化效率最高。
　　結(jié)論:1.小分子化合物誘導(dǎo)刺激后從擬胚體爬出的細(xì)胞具有角膜上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)的特點(diǎn)，并且隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加;2.免疫熒光、PCR和WB結(jié)果提示隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加，小分子化合物誘導(dǎo)組細(xì)胞胚胎干細(xì)胞多能性基因的表達(dá)消失而角膜上皮祖細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)出現(xiàn);3.不同的小分子化合物組合在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下的誘導(dǎo)效率不同;4.相同誘導(dǎo)培養(yǎng)基不相同小分子化合物在不同的誘導(dǎo)階段誘導(dǎo)