小分子化合物直接誘導(dǎo)大鼠肝干樣WB細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島素分泌細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:
　　研究用小分子化合物三步法在體外誘導(dǎo)大鼠肝上皮樣干細(xì)胞 WB-F344細(xì)胞(WB細(xì)胞)為胰島素分泌細(xì)胞(IPCs),并觀察誘導(dǎo)的胰腺前體細(xì)胞移植到糖尿病大鼠體內(nèi)能否進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為IPCs,并對(duì)體內(nèi)外誘導(dǎo)的IPCs進(jìn)行鑒定和功能評(píng)價(jià)。
　　方法:
　　1.體外誘導(dǎo)
　　1.1誘導(dǎo)方案
　　采用三步誘導(dǎo)法
　　1)第一步WB細(xì)胞去分化為WB-1細(xì)胞
　　(1)通過(guò)5-AZA5mM誘導(dǎo)培養(yǎng)

2、2天(d) TSA100 nM誘導(dǎo)1d。
　　(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:基礎(chǔ)培養(yǎng)液包括knockout-DMEM的培養(yǎng)液和一些主要成分2％knockout-serum,1 mMb-巰基乙醇,1%非必需氨基酸,1%B27,2 mM L-谷氨酸,2%N-2,20 ng/ml bFGF,20 ng/ml EGF,100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素。
　　2)第二步誘導(dǎo)分化為胰腺前體細(xì)胞WB-A細(xì)胞
　　(1)通過(guò)RA

3、2mM,聯(lián)合1乘ITS誘導(dǎo)分化7 d。
　　(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為低糖DMEM培養(yǎng)液和上述一些主要成分。
　　3)第三步在體外誘導(dǎo)分化為IPCs
　　(1)尼克酰胺10 mM培養(yǎng)7 d。
　　(2)基礎(chǔ)培養(yǎng)液去除bFGF和EGF因子。
　　1.2觀察指標(biāo)
　　1)在體外用倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)變化。
　　2)用RT-PCR、免疫熒光對(duì)WB-A細(xì)胞和IPCs進(jìn)行基因鑒定。
　　3)

4、葡萄糖刺激試驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)的IPCs進(jìn)行功能評(píng)價(jià)。
　　4)透射電鏡分析誘導(dǎo)的IPCs結(jié)構(gòu)。
　　2.體內(nèi)誘導(dǎo)
　　2.1誘導(dǎo)方案
　　胰腺前體WB-A細(xì)胞移植到糖尿病大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)分化為IPCs
　　1)將第二步誘導(dǎo)的胰腺前體 WB-A細(xì)胞1′106/只移植入糖尿病模型裸大鼠左腎囊膜下,動(dòng)態(tài)觀察血糖、體重變化;
　　2)36 d后將移植WB-A細(xì)胞組分兩亞組,將一亞組做腎切除,另一亞組保持觀察;
　　

5、3)60 d后對(duì)移植WB-A細(xì)胞和對(duì)照組分別做IPGTT和胰島素釋放實(shí)驗(yàn);
　　4)60 d后觀察移植組織的HE染色和免疫熒光分析移植細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
　　2.2觀察指標(biāo)
　　1)動(dòng)態(tài)觀察移植組的血糖變化。
　　2)移植前后血清空腹胰島素濃度。
　　3) IPGTT、胰島素釋放試驗(yàn)評(píng)估移植細(xì)胞功能。
　　4) RT-PCR檢測(cè)各階段胰腺相關(guān)基因的表達(dá)量情況。
　　5) HE染色和免疫熒光分析移

6、植組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:
　　1.體外誘導(dǎo)
　　1.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　1) WB細(xì)胞在第1階段:WB細(xì)胞由橢圓形或多邊形向梭狀細(xì)胞改變,增殖減慢,為WB-1細(xì)胞。
　　2)誘導(dǎo)的第2階段:細(xì)胞體積縮小,核漿比例增大,呈梭狀細(xì)胞改變,誘導(dǎo)分化為胰腺前體WB-A細(xì)胞。
　　3)誘導(dǎo)的第3階段:細(xì)胞核漿比例減少,胞漿增多,但無(wú)細(xì)胞聚集,在體外誘導(dǎo)分化為IPCs。
　　1.2 RT-PCR<

7、br>　　1)誘導(dǎo)的第1階段:肝臟的AFP和ALB基因表達(dá)減少,肝臟的去分化基因C/EBPb表達(dá)急劇減少,提示肝干細(xì)胞發(fā)生了去分化。
　　2)誘導(dǎo)的第2階段: WB-A出現(xiàn)了Pdx1基因表達(dá),同時(shí)表達(dá)早期發(fā)育基因Ngn3和NKX2.2。
　　3)誘導(dǎo)的第3階段: IPCs有 Pdx1、NeuroD和insulinI有表達(dá),晚期發(fā)育的基因 Pax4、Pax6和MafA,細(xì)胞功能基因 GK、Kir6.2和內(nèi)分泌基因 insuli

8、nII表達(dá)較WB-A上調(diào)。
　　1.3免疫熒光
　　5%WB細(xì)胞誘導(dǎo)為Pdx1表達(dá)細(xì)胞,IPCs細(xì)胞表達(dá)insulin。10%Pdx1表達(dá)細(xì)胞誘導(dǎo)為IPCs(0.5%WB細(xì)胞)。
　　1.4葡萄糖刺激試驗(yàn)
　　誘導(dǎo)的WB-A細(xì)胞對(duì)葡萄糖濃度變化無(wú)反應(yīng)。誘導(dǎo)的IPCs對(duì)葡萄糖濃度變化有反應(yīng)。
　　1.5透射電鏡
　　誘導(dǎo)的IPCs有胰島素分泌顆粒。
　　2.體內(nèi)誘導(dǎo):
　　2.1 WB-A細(xì)

9、胞誘導(dǎo)組血糖變化
　　1)移植WB-A細(xì)胞15天后,糖尿病大鼠血糖逐漸下降或降至正常。2)移植的36天后,腎切除組血糖又逐漸升高,腎未切除組血糖仍正常。
　　2.2 WB-A細(xì)胞誘導(dǎo)組空腹血清insulin變化
　　移植后30天較移植前1天增加2倍。
　　2.3 WB-A細(xì)胞誘導(dǎo)組功能評(píng)價(jià)
　　IPGTT和胰島素釋放實(shí)驗(yàn):與正常大鼠組分泌曲線相似。
　　2.4體內(nèi)誘導(dǎo)與體外誘導(dǎo)的IPCs的RT-PCR

10、比較
　　PC1、PC2、Pax4、Pax6、MafA、insulin II、GK和Kir6.2較體內(nèi)IPCs上調(diào), Ngn3較體內(nèi)IPCs和WB-A細(xì)胞表達(dá)下調(diào),amylase、PP、somatostatin和glucagon仍無(wú)表達(dá)。
　　2.5 WB-A細(xì)胞移植組織HE和免疫熒光
　　移植60d DM鼠的移植組織HE和免疫熒光均有insulin表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　小分子化合物能夠直接誘導(dǎo)肝干細(xì)胞為

11、 IPCs。誘導(dǎo)的胰腺前體細(xì)胞在高糖微環(huán)境下能進(jìn)一步誘導(dǎo)為IPCs并改善糖尿病大鼠血糖,體內(nèi)外誘導(dǎo)的IPCs為有功能的,高選擇性 b樣細(xì)胞。為進(jìn)一步建立肝干細(xì)胞高效、特異的向胰腺 b細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的技術(shù)體系的研究奠定了基礎(chǔ),為 DM細(xì)胞替代治療提供了有潛力細(xì)胞來(lái)源和DM臨床治療提供了新途徑。
　　目的:通過(guò)小分子化合物誘導(dǎo)WB細(xì)胞為胰腺前體細(xì)胞。
　　方法:1.通過(guò)5-AZA5mM誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d, TSA100 nM誘導(dǎo)1 d,

12、誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液。2. RA聯(lián)合ITS誘導(dǎo)7d,低糖 DMEM培養(yǎng)液和上述一些主要成分。3.在體外用倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)變化。用RT-PCR、免疫熒光對(duì)WB-A細(xì)胞進(jìn)行基因鑒定。
　　結(jié)果:1.誘導(dǎo)的第1階段:WB細(xì)胞在5-AZA5mM處理2 d,TSA1 d第1階段誘導(dǎo)后,WB細(xì)胞由橢圓形或多邊形向梭狀細(xì)胞改變,增殖減慢。誘導(dǎo)的第2階段:經(jīng)RA聯(lián)合ITS誘導(dǎo)7d第2階段,細(xì)胞體積縮小,核漿比例增大,呈梭狀細(xì)

13、胞改變。2. RT-PCR檢測(cè)第1階段肝臟的AFP和ALB基因表達(dá)減少,肝臟的去分化基因 C/EBPb表達(dá)急劇減少,提示肝干細(xì)胞發(fā)生了去分化。誘導(dǎo)的第2階段:WB-A出現(xiàn)了Pdx1基因表達(dá),同時(shí)表達(dá)早期發(fā)育基因Ngn3、NKX2.2。胰腺晚期的發(fā)育基因 Pax4、Pax6和MafA未能檢測(cè)到。胰腺b細(xì)胞功能基因GLUT2、PC1/3和PC2在WB細(xì)胞和WB-A細(xì)胞均能檢測(cè)到,胰腺內(nèi)分泌基因insulinI有少量表達(dá)。非 b細(xì)胞內(nèi)分泌基因

14、 somatostatin、glucagon、PP和外分泌基因 amylase均無(wú)表達(dá)。ALB、AFP和C/EBPb無(wú)表達(dá)。3.免疫熒光:5%WB細(xì)胞誘導(dǎo)為 Pdx1表達(dá)細(xì)胞。
　　結(jié)論:通過(guò)序貫的給予5-AZA、TSA、RA和ITS等小分子化合物,我們成功地誘導(dǎo) WB細(xì)胞為胰腺前體細(xì)胞。
　　目的:探討通過(guò)小分子化合物誘導(dǎo)胰腺前體細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為IPCs。
　　方法:1.在基礎(chǔ)誘導(dǎo)液去掉EGF、bFGF,并加10

15、 mM尼克酰胺培養(yǎng)7d,第三步完成的細(xì)胞為 IPCs。2.在體外用倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)變化,用RT-PCR、免疫熒光對(duì)WB-A細(xì)胞和IPCs進(jìn)行基因鑒定,透射電鏡分析誘導(dǎo)的IPCs結(jié)構(gòu),葡萄糖刺激試驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)的IPCs進(jìn)行功能評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:1.誘導(dǎo)的第3階段:尼克酰胺誘導(dǎo)7天后,細(xì)胞核漿比例減少,胞漿增多,但無(wú)細(xì)胞聚集,在體外誘導(dǎo)分化為IPCs。2. RT-PCR:IPCs有Pdx1、NeuroD和insulin

16、 I有表達(dá),晚期發(fā)育的基因Pax4、Pax6和MafA,β細(xì)胞功能基因 GK、Kir6.2和內(nèi)分泌基因 insulin II表達(dá)較WB-A上調(diào)。PC1/3、PC2和GLUT2基因表達(dá)較 WB-A上調(diào)。ALB、AFP和C/EBPb仍無(wú)表達(dá)。3.免疫熒光:IPCs細(xì)胞表達(dá)Pdx1,IPCs表達(dá)insulin。10%Pdx1表達(dá)細(xì)胞誘導(dǎo)為IPCs(0.5%WB細(xì)胞)。4.葡萄糖刺激試驗(yàn):IPCs對(duì)葡萄糖濃度變化有反應(yīng)。5.透射電鏡下,誘導(dǎo)的I

17、PCs有胰島素分泌顆粒。
　　結(jié)論:我們成功通過(guò)小分子化合物誘導(dǎo)胰腺前體 WB-A細(xì)胞在體外分化為IPCs。
　　目的:探討通過(guò)體內(nèi)高糖微環(huán)境能否誘導(dǎo)胰腺前體細(xì)胞在體內(nèi)誘導(dǎo)分化為IPCs,并與體外誘導(dǎo)的IPCs進(jìn)行基因表達(dá)的比較和功能評(píng)價(jià)。
　　方法:1.將第二步誘導(dǎo)的WB-A細(xì)胞1′106/只移植入糖尿病模型裸大鼠左腎囊膜下,動(dòng)態(tài)觀察血糖變化。2.并觀察移植后30 d與移植前1 d的血清空腹胰島素濃度。3.36 d后

18、將移植WB-A細(xì)胞組分兩亞組,將一組行腎切除,另一組保持觀察。4.60 d后對(duì)移植WB-A細(xì)胞和DM組及正常組分別做IPGTT和胰島素釋放實(shí)驗(yàn)。5.觀察60 d后WB-A細(xì)胞移植組織的HE染色和免疫熒光分析移植細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:1.移植WB-A細(xì)胞15天后,糖尿病大鼠血糖逐漸下降或降至正常。36天后切除腎組織的大鼠血糖又逐漸升高。2.空腹血清insulin變化:在移植后30天較移植前1天增加2倍。3.功能評(píng)價(jià):移植WB

19、-A細(xì)胞的糖尿病大鼠60d后, IPGTT和葡萄糖刺激試驗(yàn)與正常大鼠組分泌曲線相似。4. HE和免疫熒光:移植WB-A細(xì)胞的糖尿病大鼠60d后,移植物的HE和免疫熒光均有 insulin表達(dá)。5. RT-PCR:PC1、PC2、Pax4、Pax6、MafA、insulin II、GK和Kir6.2較體內(nèi)IPCs上調(diào),在WB-A細(xì)胞中無(wú)表達(dá)。Ngn3較體內(nèi)IPCs和WB-A細(xì)胞表達(dá)下調(diào)。Amylase、PP、somatostatin和gl