體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞.pdf

1、研究背景：Ⅰ型糖尿病是由于胰島β細(xì)胞受到細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性破壞，自身不能合成和分泌胰島素而造成的，是北美和歐洲兒童、青少年治療困難的慢性疾病之一，平均發(fā)病率為0.2％，占所有青少年糖尿病總數(shù)的80％(PeckAB，2004)。為了維持血糖穩(wěn)定，這些患者終生必須每天注射外源性胰島素，給患者造成巨大的生理和心理痛苦。外源性的胰島素難以完全模擬胰島素正常生理分泌，容易引起機(jī)體血糖內(nèi)穩(wěn)定紊亂，出現(xiàn)酮癥酸中毒、低血糖等嚴(yán)重后果。更危險的是，長期

2、糖代謝紊亂而繼發(fā)的糖尿病性微血管病變，導(dǎo)致的糖尿病慢性并發(fā)癥如腎功能衰竭、失明、心腦血管疾病等，影響了患者的生活質(zhì)量，也是造成患者死亡的主要原因。 胰島移植為糖尿病治療帶來了曙光，理論上胰島移植成功后不但能有效的控制血糖，而且可以恢復(fù)胰島正常的生理功能，維持血糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從根本上提高Ⅰ型糖尿病患者的生活質(zhì)量。但是經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用，胰島移植并沒有達(dá)到預(yù)期的治療效果，主要原因在于：①供體數(shù)量極其有限；②胰島移植物的質(zhì)量和數(shù)量難于

3、控制；③移植物免疫排斥反應(yīng)(SoriaB，2001)；④胰島移植并不能延緩自身免疫反應(yīng)的進(jìn)展。如何解決這些問題，尤其是移植物的問題，成為提高胰島移植，甚至細(xì)胞移植成功率的關(guān)鍵。 隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞甚至胰島成為近年研究的又一熱點。從胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemCells，ESC)誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞已經(jīng)取得了一定進(jìn)展(LumelskyN，2001；AssadyS，2001)，

4、但是ESC建系和培養(yǎng)是比較復(fù)雜的，而且即使建立了ESC系，甚至定向誘導(dǎo)分化了足夠的胰島，對于移植受體來說，只能提供同種異體的移植物，免疫排斥的問題沒有實質(zhì)性解決。 近年來發(fā)現(xiàn)成熟動物個體內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MesenchymalStemCells，MSCs)具有全能干細(xì)胞的特點，可以發(fā)生跨胚層的橫向分化，這些發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞移植治療提供了新的來源。其中研究的最多的是骨髓MSCs，骨髓MSCs具有極強(qiáng)的自我更新能力及多向分化潛能(Krau

5、seDS，2001)，最近研究顯示骨髓移植后受體糖尿病鼠胰腺組織增生，生存率改善(IanusA，2003；HessD，2003)；更有研究發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs體外能橫向分化為產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞(OhSH，2004)，表達(dá)多種胰島β細(xì)胞發(fā)育和功能相關(guān)的基因(JahrH，2003)。雖然骨髓MSCs向內(nèi)分泌系統(tǒng)的研究已經(jīng)取得了上述成就，但是其體外分化為胰島效率低，胰島素分泌量低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足移植治療糖尿病的需要(Dong-QiTang，2004)

6、。如何提高其誘導(dǎo)分化率是困擾人們的難題。 胰腺十二指腸同源框-1基因(PancreaticDuodenalHomeobox-1，PDX-1)能調(diào)節(jié)多種β細(xì)胞功能相關(guān)基因表達(dá)，對胰腺器官發(fā)生和胰島個體發(fā)育均具有重要作用；PDX-1能在ESC中調(diào)控胰島素相關(guān)基因表達(dá)(MiyazakiS，2004)；將PDX-1基因轉(zhuǎn)染某些非胰島β細(xì)胞(如肝細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞)后，這些細(xì)胞可以產(chǎn)生胰島素(FeberS，2000；YangLJ，2002

7、)；如果能獲得大量有生物活性的PDX-1基因轉(zhuǎn)染骨髓MSCs，可能會提高骨髓MSCs體外誘導(dǎo)分化的定向性，增加誘導(dǎo)效率從而提供足量的供移植胰島細(xì)胞，一方面分離患者自身骨髓MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化產(chǎn)生胰島細(xì)胞進(jìn)行白體移植可避免移植排斥反應(yīng)，另一方面，骨髓移植可誘導(dǎo)微嵌合性，延緩自身免疫反應(yīng)的進(jìn)展，從根本上解決Ⅰ型糖尿病的問題，將在糖尿病細(xì)胞治療中具有重要意義。因此本研究擬構(gòu)建含有PDX-1基因的真核表達(dá)載體，探討PDX-1基因表達(dá)在骨髓MSC

8、s體外分化為胰島樣細(xì)胞中的作用，并同種異體移植觀察骨髓MSCs來源的胰島樣細(xì)胞對鏈脲佐菌素(STZ)所致糖尿病模型大鼠的治療效果，為胰島移植和胰島發(fā)育機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。本試驗分為三個部分： 一、胰腺十二指腸同源框-1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建目的：構(gòu)建含有PDX-1基因的真核表達(dá)載體，為糖尿病細(xì)胞移植奠定基礎(chǔ)。 方法：提取胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞株總RNA，通過RT-PCR體外擴(kuò)增大鼠PDX-1基因，經(jīng)BglⅡ、HindⅢ雙酶切后整合

9、入經(jīng)相同酶切的含綠色熒光蛋白(GFP)載體pEGFP-C2，構(gòu)成重組質(zhì)粒，再進(jìn)行雙酶切電泳篩選、鑒定并測序。 結(jié)果：擴(kuò)增的目的片斷經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示在700bp和900bp之間呈現(xiàn)單一特異性條帶；重組載體雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示一條850bp目的基因片斷以及一條4.3kb的載體片斷，表明PDX-1基因片斷已被成功的插入到pEGFP-C2中；序列測定結(jié)果顯示克隆的目的基因序列與GeneBank報道的基因序列一致。

10、結(jié)論：成功構(gòu)建含有PDX-1基因的真核表達(dá)載體，為構(gòu)建含PDX-1基因的工程細(xì)胞進(jìn)行糖尿病的細(xì)胞/基因治療奠定了基礎(chǔ)。 二、Superfect高效介導(dǎo)外源性基因在骨髓間充質(zhì)干胞表達(dá)目的：提高外源性基因在骨髓MSCs中的表達(dá)效率。方法：Percoll分離液培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs，采用間接免疫熒光染色檢測MSCs表面抗原表達(dá)；觀察MSCs生長特性，繪制生長曲線，測定貼壁率；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期后，以Superfect介導(dǎo)含有目的基因

11、PDX-1的重組載體轉(zhuǎn)染骨髓MSCs，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率和MTT檢測細(xì)胞生存率對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化；間接免疫熒光染色檢測PDX-1基因轉(zhuǎn)染后瞬時表達(dá)后，G418篩選陽性細(xì)胞，通過熒光顯微鏡、RT-PCR和Westernblotting檢測PDX-1基因在骨髓MSCs中的穩(wěn)定表達(dá)。 結(jié)果：大鼠骨髓MSCs體外生長狀況相對穩(wěn)定，3代后倍增時間波動于55-56h；傳代后12h，細(xì)胞貼壁率＞90％；間接免疫熒光顯示MSCs不表達(dá)C

12、D34，表達(dá)CD59、CD90.1；流式細(xì)胞儀顯示細(xì)胞周期處于G0/G1期的細(xì)胞總數(shù)占85.9％，提示多數(shù)細(xì)胞處于靜止期；重組載體和Superfect以1：4配比、孵育細(xì)胞3h時轉(zhuǎn)染效果最佳；成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在熒光顯微鏡下顯示全細(xì)胞綠色熒光，間接熒光免疫化學(xué)染色顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表達(dá)PDX-1；G418篩選后，熒光顯微鏡顯示隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，陽性細(xì)胞比例逐漸增多，與RT-PCR和Westernblotting結(jié)果相似。 結(jié)論：大鼠M

13、SCs在體外培養(yǎng)下，生長性狀穩(wěn)定，適應(yīng)性強(qiáng)；Superfect能高效介導(dǎo)外源性基因在骨髓MSCs中表達(dá)；轉(zhuǎn)染外源性基因的MSCs可望成為一種理想的基因治療的靶細(xì)胞。 三、PDX-1促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為胰島樣細(xì)胞目的：提高骨髓MSCs體外分化為胰島樣細(xì)胞的效率，為自體骨髓MSCs移植治療糖尿病奠定基礎(chǔ)。 方法：重組載體轉(zhuǎn)染MSCs后G418篩選，隨后進(jìn)行分步法體外誘導(dǎo)分化；SABC細(xì)胞免疫化學(xué)染色和Weste

14、rnblotting檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素的表達(dá)；并用胰島素ELISA試劑盒測定誘導(dǎo)后細(xì)胞的胰島素分泌功能；最后進(jìn)行同種異體移植觀察重組載體轉(zhuǎn)染的骨髓MSCs對鏈脲佐菌素(STZ)所致糖尿病模型大鼠的治療效果；轉(zhuǎn)染空白載體和未轉(zhuǎn)染的骨髓MSCs作為對照。結(jié)果：誘導(dǎo)分化后骨髓MSCs聚集形成類似胰島的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸有細(xì)胞從團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)周邊增殖出來；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示誘導(dǎo)后在細(xì)胞團(tuán)塊中央出現(xiàn)大量胰島

15、素陽性細(xì)胞，伴隨在邊緣區(qū)域，出現(xiàn)數(shù)量不等的胰高血糖素、生長抑素陽性細(xì)胞；PDX-1+MSCs分化為胰島素陽性細(xì)胞比率(28.23％±2.56％)高于轉(zhuǎn)染空白載體和未轉(zhuǎn)染的MSCs(PDX-1-MSCs)體外分化效率(陽性率分別為7.23％±1.56％和4.08％±2.69％)；WesternBlotting檢測顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)胰島素、胰高血糖素、生長抑素蛋白，且PDX-1+MSCs上述蛋白表達(dá)明顯增多，與細(xì)胞免疫組化結(jié)果相似；ELIS

16、A檢測顯示PDX-1+MSCs誘導(dǎo)后對不同濃度葡萄糖反應(yīng)敏感(25mM高濃度葡萄糖和5mM低濃度葡萄糖刺激的胰島素分泌量分別為115.29±2.56μU/mL和56.61±4.82μU/mL)；同種異體移植后可以恢復(fù)糖尿病模型大鼠的血糖水平，移植物平均存活時間30.5±15.7d。 結(jié)論：大鼠骨髓MSCs體外能分化為胰島樣細(xì)胞；PDX-1能顯著增強(qiáng)大鼠骨髓MSCs體外分化為胰島樣細(xì)胞的能力；骨髓MSCs體外分化的胰島樣細(xì)胞移植能

17、改善STZ糖尿病大鼠的生存狀態(tài)。綜上所述，本研究結(jié)論如下： 1.國內(nèi)首次成功構(gòu)建含有胰腺十二指腸同源框-1基因的真核表達(dá)載體。 2.在國際上率先應(yīng)用新型納米轉(zhuǎn)染介質(zhì)Superfect介導(dǎo)含有PDX-1基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入骨髓MSCs，為骨髓MSCs作為糖尿病基因治療的靶細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。 3.本研究在證明骨髓MSCs體外能分化為胰島樣細(xì)胞的基礎(chǔ)上，隨后發(fā)現(xiàn)PDX-1能促進(jìn)骨髓MSCs體外分化為胰島樣細(xì)胞的能力，獲