骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為肝樣細胞的實驗研究.pdf

1、目的：通過肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）和表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）聯(lián)合應用，兔骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells， BM-MSCs)體外誘導分化為肝樣細胞，研究兔BM-MSCs誘導為肝樣細胞的能力，并對誘導后的細胞進行功能鑒定。同時，將誘導后的肝樣細胞經(jīng)門靜脈植入肝硬化兔體內(nèi)，

2、從肝功能和肝臟組織切片變化情況觀察這些細胞對肝硬化兔的的治療作用，以及在肝臟損傷修復中的應用價值，為終末期肝臟疾病的治療提供種子細胞。
　　 方法：1．兔BM-MSCs分離，培養(yǎng)及誘導：無菌條件下抽取兔骨髓5ml，采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法獲取兔BM-MSCs，傳代純化、擴增。并對第三代BM-MSCs應用流式細胞儀檢測CD29、CD44和CD34，進行表型鑒定，然后在HGF和EGF的誘導條件下定期觀察其形態(tài)學變化，應用免疫細

3、胞染色，Shiff液糖原染色，從肝細胞的表面標志和肝細胞的合成、分泌功能來檢測誘導情況。2．兔肝硬化模型的建立：28只健康普通級大白兔，雙下肢外側(cè)交替多點皮下注射40％CCl4橄欖油溶液每周2次，連續(xù)8周，期間每2周采集血樣本，檢查肝生化指標，8周后隨機宰殺2只，取肝臟組織做病理學檢查，檢驗建模情況。3．肝硬化兔的細胞移植：建模成功后，隨機分為兩組，行開腹術，實驗組兔經(jīng)門靜脈內(nèi)注射BrdU標記的肝樣細胞，對照組則用相同體積生理鹽水經(jīng)門靜

4、脈注射。術前、術后青霉素40萬U/kg肌肉注射，預防感染。術后不同時問點采集血樣本，檢查肝生化指標。術后21d將兔處死，取肝臟標本，做組織切片行病理學檢查。
　　 結(jié)果：1．兔BM-MSCs在傳代、純化、擴增后體外經(jīng)HGF、EGF的誘導條件下，于21d發(fā)現(xiàn)細胞呈類圓形，免疫細胞染色顯示，AFP和ALB表達均呈陽性，糖原染色亦陽性表達，表明兔BM-MSCs可以向肝樣細胞轉(zhuǎn)化。
　　 2．在建立肝硬化兔模型時，隨著CCl4注

5、射時間的延長，通過觀察肝生化指標，發(fā)現(xiàn)于第8周時，兔AST和ALT值分別為107.5±28.0、187.7±41.5U/L，均顯著升高（P＜0.05），ALB24.9±7.1g/L，顯著降低（P＜0.05）。通過對兔肝臟大體和組織切片的觀察，發(fā)現(xiàn)兔肝臟呈現(xiàn)肝硬化再生結(jié)節(jié)和假小葉。
　　 3．誘導后的肝樣細胞經(jīng)門靜脈移植后，肝硬化兔的生化指標隨時間推移，逐漸好轉(zhuǎn)（P＜0.05），實驗組兔肝生化指標與對照組相比較，發(fā)生了明顯的改變(

6、P＜0.05)。BrdU免疫組織化學染色顯示：在匯管區(qū)和肝索肝竇內(nèi)均可見BrdU陽性細胞。肝臟病理學表現(xiàn)為肝寞間隙內(nèi)有少量再生肝細胞團，而對照組肝纖維化未見明顯改變。
　　 結(jié)論：1．兔BM-MSCs經(jīng)含HGF和EGF的誘導體系進行誘導21d后，能夠表達AFP、ALB和糖原等肝細胞標志物，實驗表明兔BM-MSCs具有向肝樣細胞分化的能力。
　　 3．實驗兔經(jīng)皮下注射CCl48周后，肝臟組織切片呈現(xiàn)典型的假小葉，此方法可以