同種異體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：本實驗通過體外分離培養(yǎng)同種異體大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），了解其一般生物特性及低免疫原性，探討同種異體大鼠MSCs在肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor HGF）和成纖維生長因子4（basic fibroblast factor FGF-4）誘導(dǎo)下向肝樣細(xì)胞（hepatocyte-like cells）橫向分化的可能性，以期為臨床同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治

2、療終末期肝病提供理論基礎(chǔ)。 方法： 1.無菌條件下取出大鼠的兩側(cè)股骨，沖洗骨髓腔獲得細(xì)胞，采用全骨髓培養(yǎng)法體外培養(yǎng)細(xì)胞，貼壁篩選純化大鼠MSCs并進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增。 2.取第三代MSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀測試CD34、CD45、CD29、CD106，并誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞分化。 3.取兩只大鼠第三代MSCs混合培養(yǎng)，加入一定濃度的HGF和FGF-4對MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)，未加入生長因子組作為對照組，觀察誘導(dǎo)細(xì)胞的形

3、態(tài)學(xué)變化，免疫組化檢測培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白-18 （cytokeratin-18 CK-18）、細(xì)胞角蛋白-19（cytokeratin-19 CK-19）及波形蛋白Vimentin；ELISA等方法檢測甲胎蛋白（alpha-fetoprotein AFP）、白蛋白（albumin ALB）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase ALP）。 結(jié)果： 1.剛分離接種的大鼠骨髓MSCs形態(tài)大小均一。大鼠

4、MSCs在24h內(nèi)貼壁，10天左右達(dá)到對數(shù)生長期。細(xì)胞傳至第三代時候，細(xì)胞融合成單層，梭形突起變長，排列有明顯方向性，呈旋渦狀、魚群樣。 2.第三代大鼠MSCs流式細(xì)胞儀檢測CD34、CD45陰性，CD29、CD106陽性，MSC誘導(dǎo)后分化為脂肪細(xì)胞。 3.混合培養(yǎng)的大鼠MSCs經(jīng)HGF和FGF-4共同誘導(dǎo)后7天后，開始觀察到少量細(xì)胞變成短梭形，誘導(dǎo)14天后可以觀察到細(xì)胞變成三角形或是橢圓形，隨時間的延長橢圓形細(xì)胞越多。

5、而未加誘導(dǎo)因子的對照組未觀察到三角形及橢圓形細(xì)胞的出現(xiàn)，細(xì)胞仍呈梭形生長，并相互融合。當(dāng)誘導(dǎo)的細(xì)胞大部分變成橢圓形后，行免疫組化及ELASA檢測，結(jié)果顯示CK18、CK19、Vimentin表達(dá)陽性，AFP、ALB、ALP出現(xiàn)明顯改變。 結(jié)論： 1.HGF和FGF-4的共同作用可以促進(jìn)同種異體大鼠MSCs橫向分化為肝樣細(xì)胞。 2.10％胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基適合大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)和分化。 3.骨髓