大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導肝星狀細胞系凋亡.pdf

1、目的：研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)體外誘導大鼠肝星狀細胞(HSCs)凋亡及其機制。
　　 方法：MSCs的分離：從SD雄性大鼠的股骨骨髓中獲得，經(jīng)分離，培養(yǎng)，傳代至第4代使用；大鼠肝星狀細胞系(HSC-T6)及纖維原細胞系復蘇后傳代使用。用6孔塑料培養(yǎng)板，在半透膜(transwell insert)上層接種MSCs(2×105cells/well)，在下層接種HSC-T6細胞(2×105cells/well)，建立上下雙

2、層細胞共培養(yǎng)體系，常規(guī)培養(yǎng)。實驗分組：①空白對照組：HSCs單獨培養(yǎng)；②陰性對照組：纖維原細胞(Fiberoblasts)與HSCs共培養(yǎng)；③MSCs組：MSCs與HSCs共培養(yǎng)。以上體系培養(yǎng)觀察24h，48h和72h，于倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察HSCs細胞形態(tài)；免疫組化法檢測HSCs a-SMA表達；WST-8法檢測HSCs增殖抑制率；流式細胞儀Annexin-V-FITC/PI雙染法和DNA凝膠電泳(DNA Ladder)檢測HSC

3、s細胞凋亡；RT-PCR檢測HSCs Caspase-3，Bax基因mRNA表達；Western blot檢測HSCs Caspase-3，Bax蛋白表達。
　　 結(jié)果：(1)MSCs與HSCs共培養(yǎng)24h，48h和72h，HSCs表現(xiàn)明顯增殖抑制(P＜0.01)，且呈現(xiàn)時間依賴性，MSCs組與空白對照組、陰性對照組比較均有顯著性差異(P＜0.01；P＜0.01)。(2)流式細胞儀Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測MS

4、Cs與HSCs共培養(yǎng)后HSCs的凋亡率：共培養(yǎng)24h后HSCs凋亡率呈現(xiàn)時間依賴性，與空白對照組和陰性對照組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.01；P＜0.01)。(3)DNA凝膠電泳(DNA Ladder測定)MSCs組中出現(xiàn)了明顯的DNA Ladder，空白對照組和陰性對照組中無DNA Ladder。(4)RT-PCR檢測共培養(yǎng)后各組HSCs的Caspase-3，Bax mRNA表達：共培養(yǎng)24h后，MSCs組Caspase-3，Bax m

5、RNA表達呈現(xiàn)時間依賴性，與空白對照組、陰性對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01；P＜0.01)。(5)Western blot檢測共培養(yǎng)后各組HSCs的Caspase-3，Bax蛋白質(zhì)表達：MSCs組24h后Caspase-3，Bax表達呈現(xiàn)時間依賴性，與空白對照組，陰性對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01；P＜0.01)。
　　 結(jié)論：(1)MSCs可在體外抑制HSCs增殖和誘導其凋亡。(2)MSCs可能通過旁分泌途徑誘