大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化神經(jīng)元樣細胞的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs）是目前備受關(guān)注的一類多向分化潛能組織干細胞，在特定的條件下，MSCs可以跨胚層分化成神經(jīng)細胞[1]，骨髓間充質(zhì)干細胞能被誘導分化為神經(jīng)元樣細胞。多種原因致面神經(jīng)損傷成為口腔頜面部最常見疾病，因神經(jīng)纖維的不可再生性，嚴重影響疾病治療和患者預后，成為人們面臨的難題。如何進行疾病治療，改善患者預后是各國學者廣泛研究的焦點，

2、人們將眼光投向干細胞移植治療，細胞替代治療成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的新途徑[2]。本實驗探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)條件，體外定向誘導傳代骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)化并進一步向神經(jīng)紐胞分化，對分化后的神經(jīng)元樣細胞進行鑒定。
　　 實驗方法：
　　 1、選用健康SD大鼠，分離純化并培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　 2、應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞表面抗原的表達，通過免疫表型鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　 3、

3、貼壁培養(yǎng)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化，分為對照組和誘導劑組。對照組中不加誘導劑；誘導劑組分兩步誘導：首先加入不同濃度表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子誘導分化劑，連續(xù)培養(yǎng)6d；然后應(yīng)用腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和全反式維甲酸繼續(xù)誘導6d，分別收集誘導后第3d、6d、9d的細胞進行細胞免疫熒光鑒定和免疫組化鑒定。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、傳代第3代骨髓間充質(zhì)干細胞為梭形成纖維樣細胞，均一穩(wěn)定的表達與間充質(zhì)干細胞相關(guān)的表

4、面抗原標記物CD29，CD44，CD90，陽性率分別為98.76％，98.41％，96.58％，但極少表達CD34，CD45。
　　 2、經(jīng)堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）和表皮生長因子（EGF）共同誘導6d后，誘導劑組巢蛋白（NESTIN）陽性表達率約為83％，而對照組細胞未表達巢蛋白。
　　 3、經(jīng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和全反式維甲酸（ATRA）聯(lián)合誘導6d后，誘導劑組均可見微管相關(guān)蛋白2陽性細胞（MAP2

5、），神經(jīng)絲（NF）及神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）陽性細胞，大部分細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細胞形態(tài)，與對照組相比有顯著差異（P<0.05），對照組細胞形態(tài)仍為梭形成纖維樣細胞。
　　 結(jié)論：
　　 1、實驗采用改良的全骨髓貼壁法，操作簡單快速，細胞活性好，是一種較為理想的分離和純化骨髓間充質(zhì)干細胞的方法。
　　 2、bFGF和EGF兩種預誘導劑同時用比bFGF和EGF單一使用效果好。
　　 3、bFGF和EGF

6、聯(lián)合用的3種濃度（50ug/1、100ug/1、150ug/1）中，100ug/1濃度預誘導效果為最佳，誘導出神經(jīng)干細胞數(shù)量多。
　　 4、經(jīng)過ATRA和BDNF聯(lián)合誘導分化的細胞，能夠?qū)⒋蟛糠稚窠?jīng)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞。
　　 5、鑒定細胞方法多，本實驗應(yīng)用流式細胞儀鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞，免疫組化和免疫熒光鑒定誘導后神經(jīng)元樣細胞。
　　 6、鑒定細胞試劑種類多，本實驗應(yīng)用CD29、CD90、CD45、CD44