體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向GABA能神經(jīng)元分化.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）作為來(lái)源于中胚層的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有容易進(jìn)行分離純化培養(yǎng)且能避開(kāi)自體移植的免疫障礙，同時(shí)還突破了神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell,NSC)和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)研究的倫理束縛等等鮮明特點(diǎn)，近來(lái)成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)趨勢(shì)。BMSCs在適當(dāng)條件下可向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)

2、胞、神經(jīng)細(xì)胞等方向分化，尤其向神經(jīng)細(xì)胞方向分化的趨勢(shì)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷病人帶來(lái)了新的福音。目前研究表明BMSCs對(duì)大鼠癲癇模型有一定的療效，γ-氨基丁酸（gama aminobutyric acid,GABA）能神經(jīng)元損傷作為癲癇的關(guān)鍵發(fā)病因素，BMSCs是否具有分化為GABA能神經(jīng)元的能力還未有明確報(bào)道，同時(shí)體外誘導(dǎo)分化的GABA能神經(jīng)元的功能性還有待進(jìn)一步研究。本論文在前面學(xué)者研究NSC和BMSCs分化的基礎(chǔ)上，結(jié)合GABA能神經(jīng)元

3、自身誘導(dǎo)分化的特點(diǎn)，成功在體外將BMSCs誘導(dǎo)分化為GABA能神經(jīng)元。盡管目前研究顯示其向GABA能神經(jīng)元分化效率和相應(yīng)功能有限，但此研究的初步結(jié)果為臨床應(yīng)用BMSCs治療癲癇奠定了一定的理論基礎(chǔ)，為顱腦病變的細(xì)胞移植替代治療開(kāi)辟了新的方向。本論文從BMSCs的分離培養(yǎng)、BMSCs的誘導(dǎo)分化兩個(gè)方面作以探索性研究：
　　1、BMSCs的分離培養(yǎng)。
　　目的獲取純化的BMSCs。方法用10ml無(wú)菌注射器吸取PBS沖洗鼠齡4-6

4、w、體重100g左右的SD大鼠股骨骨髓腔，收集5ml左右的骨髓液，緩慢沿試管壁加入到等體積的Percoll（1.073g/ml）分離液中，而后以2500rpm的速度高速離心20min，謹(jǐn)慎吸取試管內(nèi)液體交界面處的薄層細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含PBS的試管中，吹打后以1000rpm的速度離心5min，倒掉PBS然后在細(xì)胞中加入含10％FBS的DNEM/F12，吹打均勻后以1×106個(gè)/ml的濃度轉(zhuǎn)移移到40ml的塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，即為原代細(xì)胞。靜止培養(yǎng)

5、3天后先半量換液，以后正常換液，大約10-12天待細(xì)胞鋪滿瓶底70％左右時(shí)傳代培養(yǎng)，獲得第1代細(xì)胞。以此類推。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化法分析獲取的細(xì)胞。結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)48h左右即開(kāi)始貼壁，形態(tài)多呈梭形，原代細(xì)胞呈巢狀生長(zhǎng)。傳代后細(xì)胞增殖迅速，培養(yǎng)液中有少量懸浮細(xì)胞，到第2代后細(xì)胞形態(tài)單一，基本達(dá)到純化。同時(shí)對(duì)純化細(xì)胞作免疫組化分析發(fā)現(xiàn)其表面標(biāo)志抗體的表達(dá)情況為CD29(91.3±5.0)％、CD105(72.1±6.3)％和CD34(2.

6、4±0.8)％。結(jié)論通過(guò)大鼠骨髓的分離培養(yǎng)，在第2代即可得到比較純化的BMSCs。此結(jié)論為BMSCs的誘導(dǎo)分化提供了有利前提。
　　2、體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs向GABA能神經(jīng)元分化。
　　目的探討B(tài)MSCs向GABA能神經(jīng)元的分化趨向。方法取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第二代BMSCs添加NSC培養(yǎng)基培養(yǎng)一周,而后加入10ng/ml腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）和10ng

7、/ml骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）誘導(dǎo)3-4天，再以1μmol/L全反式維甲酸（all transretinoic acid,ATRA）誘導(dǎo)3-4天完成分化。觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)在誘導(dǎo)分化中的變化，免疫熒光和Westernblot鑒定分化后細(xì)胞并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果細(xì)胞在添加NSC培養(yǎng)基3天后即開(kāi)始出現(xiàn)變化，到一周時(shí)細(xì)胞明顯變圓，透光性增強(qiáng)。添加BDNF和BMP-2后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)突起，

8、至誘導(dǎo)分化完成時(shí)細(xì)胞擁有明顯的胞體和突起，呈典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)。免疫熒光發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞抗體陽(yáng)性：Nestin(27.3±5.6)％、NSE(37.6±4.6)％和GAD67(18.7±5.7)％。Westernblot分析顯示，經(jīng)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞GAD67和NSE的蛋白條帶相對(duì)灰度值明顯高于未誘導(dǎo)分化細(xì)胞的灰度值。結(jié)論BMSCs在體外有向GABA能神經(jīng)元方向分化的趨勢(shì)，在添加BMP-2趨勢(shì)更為明顯。上述結(jié)果為癲癇的細(xì)胞移植治療奠定了一定