甲鈷胺體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、目的：通過(guò)體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），初步探討不同劑量的甲鈷胺體外定向誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的可行性，以及觀察分化后的細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖情況，尋求一種較合理的甲鈷胺誘導(dǎo)濃度，為臨床上利用甲鈷胺誘導(dǎo)后的BMSCs進(jìn)行細(xì)胞移植更好更有效的治療脊髓損傷提供前期研究依據(jù)。
　　方法：1、采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)和純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況、生物活性及形態(tài)學(xué)變化，免疫熒光細(xì)胞

2、化學(xué)檢測(cè) BMSCs相對(duì)特異性表面標(biāo)志物 CD44，證實(shí)實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞為BMSCs。
　　2、取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4-5代BMSCs，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（control組）和實(shí)驗(yàn)組（分25ug/ml、50ug/ml和100ug/ml三個(gè)濃度組），實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度甲鈷胺的10％FBS L-DMEM培養(yǎng)基，對(duì)照組加入10%FBS L-DMEM，不加任何誘導(dǎo)劑，各組以24h、48h、72h為觀察記錄的時(shí)間坐

3、標(biāo)軸，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和生長(zhǎng)狀態(tài)，MTT法檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖情況，RT-PCR和western blotting方法鑒定分化的神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志物神經(jīng)巢蛋白（neuroepithelial stem cell protein，Nestin）和神經(jīng)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neon-specific enolase，NSE）的表達(dá)。
　　結(jié)果：1、原代細(xì)胞接種24-48小時(shí)后可見(jiàn)貼壁細(xì)

4、胞，貼壁細(xì)胞單個(gè)散在分布，多數(shù)細(xì)胞呈小圓形或橢圓形。72小時(shí)后可見(jiàn)散在的梭形細(xì)胞，一周左右細(xì)胞形成集落，細(xì)胞呈梭形、三角形或星形。原代培養(yǎng)約兩周，細(xì)胞增殖明顯加快，集落中的細(xì)胞增殖成“漩渦狀”，具有典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定顯示BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44表達(dá)陽(yáng)性，造血干細(xì)胞表面抗原CD34表達(dá)陰性。
　　2、BMSCs經(jīng)25ug/ml、50ug/ml和100ug/ml誘導(dǎo)24h、48h和72h后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)

5、胞折光性增強(qiáng)，部分細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)元樣變化，具有神經(jīng)元樣形態(tài)：細(xì)胞向周?chē)L(zhǎng)出較長(zhǎng)的突起，有立體感，折光性增強(qiáng)，倒置顯微鏡下觀察以100ug/ml組細(xì)胞折光性及突觸延長(zhǎng)最為明顯，并且相鄰細(xì)胞間的突觸出現(xiàn)連接，而對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，仍然呈長(zhǎng)梭形。MTT結(jié)果顯示24h、48h和72h各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），RT-PCR與western blotting結(jié)果顯示不同劑量甲鈷胺誘導(dǎo)48h后，Nestin和NSE在mRNA和

6、蛋白水平表達(dá)均上調(diào)，其中100ug/ml組表達(dá)上調(diào)最明顯，與control組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同樣，100ug/ml甲鈷胺誘導(dǎo)24h、48h和72h后，Nestin和NSE在mRNA和蛋白水平表達(dá)均上調(diào)，其中72h表達(dá)上調(diào)最明顯，與control組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1、甲鈷胺可定向誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，分化后的細(xì)胞具有一定的增殖能力；甲鈷胺對(duì)分化后的細(xì)胞生長(zhǎng)增