阿魏酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細胞體外促肝星狀細胞凋亡及機制的研究.pdf

1、目的：本實驗研究阿魏酸(Ferulic acid，F(xiàn)A)聯(lián)用大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells，ADMSCs)對活化大鼠肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）凋亡的影響。進一步探討兩者協(xié)同促HSCs凋亡作用機制，是否通過調(diào)節(jié)肝星狀細胞的TGF-β/Smad信號通路來實現(xiàn)。
　　方法：1、FA最佳藥物作用濃度的確定：①用完全培養(yǎng)基將HSCs

2、培養(yǎng)至細胞密度達60％-70％時，換無血清培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)6h、12h、24h、36h、48h，用四甲基偶氮哇藍(MTT)法測HSCs的OD值，繪制HSCs生長曲線并確定最適細胞培養(yǎng)時間。②用完全培養(yǎng)基將HSCs培養(yǎng)至細胞密度約60％-70％時，換用含不同濃度（25-800μg/mL）FA的無血清培養(yǎng)基處理HSCs，用MTT法測HSCs的細胞增殖抑制率，并計算IC50，確定FA的最佳藥物作用濃度。③用完全培養(yǎng)基將ADMSCs培養(yǎng)至細胞密

3、度達60％-70％時，換為無血清培養(yǎng)，用MTT法檢測FA對ADMSCs的存活率的影響。2、實驗分組：利用Transwell半透膜對ADMSCs和HSCs以1∶5的比例建立上下層間接共培養(yǎng)體系，當兩者細胞在完全培養(yǎng)基中達到60％-70％密度時，換為無血清培養(yǎng)，然后將HSCs分為4組：①空白對照組：HSCs單獨培養(yǎng)，不加FA和ADMSCs;②FA條件對照組：加入FA處理HSCs;③ADMSCs條件對照組：加入ADMSCs，用Transwel

4、l建立上下雙層細胞共培養(yǎng)體系。ADMSCs在上層Transwell中培養(yǎng)，HSCs在下層6孔板中培養(yǎng);④A/ADMSCs實驗組：在ADMSCs與HSCs共培養(yǎng)體系中加入FA共同作用。3、阿魏酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細胞對肝星狀細胞凋亡的影響：用流式細胞儀檢測各組HSCs的凋亡率;用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組HSCs上清液中CollagenⅠ的含量。4、阿魏酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細胞促肝星狀細胞對肝星狀細胞相關(guān)TGF-β/Smad通路研究

5、：利用qRT-PCR檢測各組HSCs中TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad7mRNA的表達水平;Western blot檢測各組HSCs中TGF-β1和Smad7蛋白、Smad2/3磷酸化(p-Smad2/3)表達變化。
　　結(jié)果：1、MTT結(jié)果顯示：本實驗換為無血清條件后的最適細胞培養(yǎng)時間為24h;不同濃度FA作用24h后，與未加FA的對照組比較，實驗組HSCs生長抑制率均顯著升高(P＜0.05)。用SPSS22.0軟

6、件中文版計算出IC50=243μg/mL。結(jié)合本課題前期實驗，確定FA的最終藥物處理濃度為200μg/mL;MTT實驗結(jié)果提示此濃度的FA對ADMSCs的存活率影響不明顯2、流式細胞儀測HSCs凋亡率結(jié)果示：與空白對照組比較，ADMSCs組中HSCs凋亡率變化無明顯統(tǒng)計學差異;FA組、FA/ADMSCs實驗組HSCs的凋亡率均明顯增高(P＜0.05)。與兩條件對照組比較，F(xiàn)A/ADMSCs實驗組中HSCs的凋亡率均顯著升高(P＜0.05

7、)。ELISA結(jié)果顯示：在無血清條件下，各組HSCs培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)上清液中的CollagenⅠ的濃度出現(xiàn)了差異。與空白對照組組比較，ADMSCs組中CollagenⅠ的濃度變化無明顯統(tǒng)計學差異：FA組、FA/ADMSCs實驗組HSCs的CollagenⅠ濃度均顯著降低(P＜0.001)。與FA組和ADMSCs組兩條件對照組比較，F(xiàn)A/ADMSCs實驗組上清中的CollagenⅠ含量顯著降低(P＜0.05或P＜0.001）。3、qRT

8、-PCR和Western blot檢測對肝星狀細胞TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路結(jié)果顯示：與空白和條件對照組比較：FA/ADMSCs實驗組中HSCs的TGF-β1、Smad2、Smad3mRNA表達明顯下降，Smad7mRNA表達明顯升高(P＜0.05或P＜0.01);FA/ADMSCs實驗組中HSCs的TGF-β1蛋白表達、Smad2/3磷酸化水平顯著降低，而Smad7蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論：阿魏酸聯(lián)