脂肪間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)及復(fù)合PLGA體內(nèi)異位成軟骨的實驗研究.pdf

1、第一章脂肪間充質(zhì)千細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。 目的:探討脂肪間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)方法，觀察其生長增殖情況，鑒定其生物性特征。 方法:以S-D大鼠為研究對象，機械分離，膠原酶消化腹股溝和附睪脂肪組織，獲取細胞培養(yǎng)于含新生牛血清體積分數(shù)為0.1的低糖DMEM培養(yǎng)基中，利用干細胞的附壁生長特性，通過更換培養(yǎng)基而不斷純化獲取脂肪間充質(zhì)干細胞，鏡下觀察細胞形態(tài)變化。MTT法測定傳3、5和10代細胞增殖情況。流式細胞儀檢測傳5代細

2、胞表面CD29、CD34和CD44表達情況。 結(jié)果:原代培養(yǎng)后24小時看見微少貼壁細胞，初起為小圓形，48小時后可見梭形、短梭形和多角形貼壁細胞，3天后成纖維樣細胞明顯增多，5天左右進入對數(shù)增長期，8天左右細胞單層融合接近90％。傳代細胞于2小時即可完成貼壁，生長較快，多數(shù)為成纖維樣細胞，6天左右細胞單層融合。傳3代后細胞形態(tài)均一。10代以后細胞則逐漸有寬大梭形樣變。生長曲線顯示傳3、5代脂肪間充質(zhì)干細胞均有較強的增殖能力，其中

3、傳5代細胞更為明顯，而傳10代細胞的增殖能力逐漸減弱。流式細胞儀檢測傳5代細胞有95％表達CD44，96％表達CD29，而只有5％表達CD34。 結(jié)論:大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞分離提取操作簡便易行，且有較強的生長增殖能力，能夠長期培養(yǎng)，符合組織工程種子細胞的基本條件。 第二章脂肪間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)成軟骨能力的實驗研究。 目的:探討脂肪間充質(zhì)干細胞在特定培養(yǎng)基條件下體外定向軟骨細胞分化的能力。 方法:(1)如

4、前述方法，分離培養(yǎng)大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞。 (2)取傳5代細胞采用初始細胞密度為1.0×10<'10>/L的"微團"培養(yǎng)方法在特定培養(yǎng)基條件下進行成軟骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為高糖DMEM，含體積分數(shù)為0.01的新生牛血清、10ug/L的轉(zhuǎn)化生長因子β1、6.25mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白、1×10<'-7>mol/L的地塞米松和50mg/L的維生素C。 (3)觀察脂肪間充質(zhì)干細胞在誘導(dǎo)后的生長增殖情況、形態(tài)變化，于誘導(dǎo)7、14天后應(yīng)用阿爾新蘭染色、甲

5、苯胺蘭染色、藩紅0/固綠染色，以及4、7、14天后應(yīng)用Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學(xué)、aggrecan免疫熒光評價其成軟骨能力。 (4)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測脂肪間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)0周、2周和4周后前Ⅱ型膠原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA表達情況。 (5)蛋白印跡試驗(Western-blot)檢測脂肪間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)0周、2周和4周后前Ⅱ型膠原蛋白和aggrecan的蛋白表達。 結(jié)果:(1)在特定培養(yǎng)基誘

6、導(dǎo)條件下，脂肪間充質(zhì)干細胞細胞生長增殖明顯減緩，細胞形態(tài)由梭型漸變?yōu)槿切巍⒍嘟切?、圓形，有自發(fā)聚集傾向，高密度的"微團"培養(yǎng)細胞在誘導(dǎo)后48小時可以聚集形成結(jié)節(jié)，并逐漸增大，12天左右結(jié)節(jié)呈半透明類軟骨樣外觀。 (2)脂肪間充質(zhì)干細胞在高密度的"微團"培養(yǎng)條件下，于誘導(dǎo)7、14天后阿爾新蘭染色、甲苯胺蘭染色、藩Co/固綠染色陽性，誘導(dǎo)4、7、14天后Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學(xué)、aggrecan免疫熒光陽性表達。(3)RT-PCR檢測高密

7、度"微團"培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)0周前Ⅱ型膠原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA呈陰性表達，而在誘導(dǎo)后2周和4周呈陽性穩(wěn)定表達。(4)Western-blot檢測在脂肪間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)后0周前Ⅱ型膠原、aggrecan的蛋白為微弱表達，而在誘導(dǎo)2周和4周后呈陽性穩(wěn)定表達。 結(jié)論:在體外特定的誘導(dǎo)環(huán)境下，高密度微團培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細胞可以向軟骨細胞方向分化，并能夠穩(wěn)定表達軟骨細胞特異表型。 第三章脂肪間充質(zhì)干

8、細胞復(fù)合PLGA體外培養(yǎng)誘導(dǎo)成軟骨的實驗研究。 目的:探討脂肪間充質(zhì)干細胞在PLGA支架上培養(yǎng)并定向軟骨方向誘導(dǎo)分化的能力，以及PLGA支架作為脂肪間充質(zhì)干細胞載體的可行性。 方法:(1)將PLGA柱狀支架，分別經(jīng)過乙醇消毒、紫外線照射滅菌處理，晾干備用。(2)如前述方法，分離培養(yǎng)大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞，取傳5代細胞，以4.0×10<'10>/L的初始細胞密度接種在PLGA支架材料上，分誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組在特定培養(yǎng)基

9、，即含體積分數(shù)為0.01的新生牛血清、10ug/L的轉(zhuǎn)化生長因子β1、6.25mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白、1×10<'-7>mol/L的地塞米松和50mg/L的維生素C的高糖DMEM條件下進行成軟骨誘導(dǎo)。 (3)于3周后取材行掃描電鏡觀察細胞在材料表面的生長增殖情況，取材石蠟包埋切片行H-E染色、藩紅0/固綠染色和Masson三色染色以及Ⅱ型膠原蛋白免疫組化、aggrecan免疫熒光評價脂肪間充質(zhì)干細胞在PLGA材料內(nèi)部的生長情況和成軟骨能力。

10、(4)應(yīng)用RT--PCR檢測脂肪間充質(zhì)千細胞/PLGA支架復(fù)合培養(yǎng)3周后未誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組前Ⅱ型膠原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA的表達情況。 結(jié)果: (1)脂肪間充質(zhì)干細胞接種在PLGA材料復(fù)合培養(yǎng)時，初起細胞/材料復(fù)合體懸浮于培養(yǎng)基中，2天后漸沉入培養(yǎng)基底部，誘導(dǎo)組復(fù)合體表面逐漸光滑潤澤，質(zhì)地逐步增韌，倒置顯微鏡下可見有少量細胞溢出支架材料并附壁生長。 (2)誘導(dǎo)組3周后掃描電鏡觀察，見細胞在支架表

11、面分布密集，并可見支架空隙細胞延伸，基質(zhì)分泌旺盛，甚至連接成片；未誘導(dǎo)組基質(zhì)分泌較少。 (3)石蠟切片H-E染色可見細胞在支架內(nèi)部生長，但數(shù)量明顯少于支架外部；石蠟切片見誘導(dǎo)組藩紅0/固綠染色和Masson三色染色以及Ⅱ型膠原蛋白免疫組化、aggrecan免疫熒光呈陽性表達，可見少量成熟軟骨陷窩形成，未誘導(dǎo)組呈陰性。 (4)在脂肪間充質(zhì)干細胞/PLGA支架復(fù)合培養(yǎng)、3周后，RT-PCR檢測誘導(dǎo)組前Ⅱ型膠原蛋白、aggre

12、can和Sox9的mRNA均呈陽定表達，未誘導(dǎo)組呈陰性。 結(jié)論:脂肪間充質(zhì)干細胞可以和PLGA支架復(fù)合培養(yǎng)，在特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下可以表達軟骨特異表型，形成類軟骨樣組織。 第四章脂肪間充質(zhì)干細胞復(fù)合PLGA體內(nèi)異位成軟骨的實驗研究。 目的:探討脂肪間充質(zhì)干細胞/PLGA材料復(fù)合體體外誘導(dǎo)后植入裸鼠體內(nèi)異位構(gòu)建組織工程化軟骨的能力。 方法:(1)如第三章所述方法，脂肪間充質(zhì)干細胞復(fù)合PLGA體外培養(yǎng)或誘導(dǎo)

13、3周。 (2)分別將誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組細胞/支架復(fù)合體植入裸鼠背部皮下兩側(cè)，觀察裸鼠的生活力變化以及皮下種植的細胞/支架復(fù)合體質(zhì)地和形態(tài)變化。 (3)分別于8周和12周取材石蠟包埋切片行H-E染色、阿爾新蘭染色、藩紅0/固綠染色和Masson三色染色以及Ⅱ型膠原蛋白免疫組化、aggrecan免疫熒光評價脂肪間充質(zhì)干細胞復(fù)合PLGA異位成軟骨能力。 (4)RT-PCR檢測體內(nèi)細胞材料復(fù)合體在8周和12周時前Ⅱ型膠原蛋白、aggrecan和S

14、ox9的mRNA的表達情況。 結(jié)果:(1)將經(jīng)過體培養(yǎng)的細胞/PLGA材料復(fù)合體植入裸鼠皮下后，裸鼠成長良好，沒有全身和局部的炎癥和毒性反應(yīng)，誘導(dǎo)組細胞/支架復(fù)合體的大小形態(tài)基本保持原狀，質(zhì)地逐步增韌；未誘導(dǎo)組細胞/支架復(fù)合在8周取材時已無明確形體殘留。 (2)在8和12周后誘導(dǎo)組取材，石蠟包埋切片，行阿爾新蘭染色、藩紅0/固綠染色和Masson三色染色，以及Ⅱ型膠原蛋白免疫組化、aggrecan免疫熒光均可見成熟軟骨陷窩生成，