兔脂肪干細胞體外培養(yǎng)后改良誘導成軟骨細胞的實驗研究.pdf

1、目的：探索兔脂肪組織中分離、培養(yǎng)及鑒定干細胞的方法；觀察體外長期培養(yǎng)對新西蘭大白兔脂肪間充質(zhì)干細胞（Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs）的基本生物學性狀及定向改良誘導分化為軟骨細胞的能力。方法：在無菌條件下從雄性大白兔頸部區(qū)取皮下脂肪組織約5～10g,I型膠原酶消化后，1500r/min離心10min，待細胞長滿瓶底80％時用2.5g/L胰蛋白酶消化，按1：3比例傳代培養(yǎng)、鑒定，至第3代時加入軟骨誘導培養(yǎng)基

2、14d后通過免疫熒光和RT-PCR對其相關表型進行檢測，阿新藍染色及II型膠原免疫組織化學檢測脂肪間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞的誘導分化。結果：兔脂肪間充質(zhì)干細胞形態(tài)：原代及傳代的兔脂肪干細胞均呈長梭形或多邊形貼壁生長,生長分化活躍。兔脂肪間充質(zhì)干細胞的生長曲線：傳代的兔脂肪間充質(zhì)干細胞生長曲線呈“S”形。新西蘭大白兔脂肪組織分離培養(yǎng)出的細胞經(jīng)流式細胞儀檢測CD44、CD49d表達陽性，CD45表達陰性。加入軟骨誘導培養(yǎng)基定向誘導72h后，細

3、胞生長緩慢，由長梭形逐漸變成圓形，并漸漸有軟骨結節(jié)形成，胞漿中出現(xiàn)棕色顆粒，細胞表面有較多偽足，具備正常細胞器結構。誘導分化2周后，熒光免疫檢測有特異軟骨基質(zhì)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達, RT- PCR檢測顯示有Ⅱ型膠原、Aggrecan和Sox- 9 mRNA的表達，阿新藍染色及II型膠原免疫組織化學檢測陽性。結論：新西蘭大白兔脂肪組織能夠分離培養(yǎng)出脂肪干細胞，兔源性脂肪干細胞體外以成纖維細胞樣形態(tài)貼壁生長，在體外具有生長穩(wěn)定, 增殖較