兔間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和體外向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1.建立一種分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的有效方法，并觀察BMSCs在特定培養(yǎng)條件下向軟骨細(xì)胞分化的情況。 2.探討使用G-CSF動(dòng)員兔外周血，分離培養(yǎng)外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(peripheral　blood mesenchymal stem cells，PBMSCs)的方法。 方法： 1.以4月齡新西蘭

2、大耳白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用密度梯度離心法、全血培養(yǎng)法、氯化胺紅細(xì)胞溶解法，分離培養(yǎng)BMSCs，對(duì)其細(xì)胞存活率、細(xì)胞克隆率、首次傳代時(shí)間、15d后細(xì)胞數(shù)及擴(kuò)增成功率進(jìn)行比較。 2.用含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)-2的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)BMSCs在體外單層培養(yǎng)模式下向軟骨細(xì)胞分化。采用甲苯胺藍(lán)染色、Masson染色、免疫組織化學(xué)染色、阿利新藍(lán)比色法測(cè)定糖胺聚糖(glycosamino

3、glycan,GAG)的含量來(lái)檢測(cè)BMSCs分化情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較第2、4、7代(P2、P4、P7)BMSCs誘導(dǎo)后增殖能力及向軟骨細(xì)胞分化能力的變化。 3.給新西蘭兔皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子30μg/(kg·d)4d，抽取動(dòng)員前后兔外周血采用密度梯度離心法進(jìn)行分離培養(yǎng)。 結(jié)果： 1.對(duì)于細(xì)胞存活率而言，密度梯度離心法和全血培養(yǎng)法均優(yōu)于氯化胺紅細(xì)胞溶解法。在其它指標(biāo)比較中，密度梯度離心法>全血培養(yǎng)法>氯化胺紅

4、細(xì)胞溶解法。 2.BMSCs定向誘導(dǎo)后表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞的特性，P2、P4間的細(xì)胞增殖能力和成軟骨細(xì)胞分化能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)：P7與P2、P4相比，細(xì)胞增殖能力和成軟骨細(xì)胞分化能力均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 3.未動(dòng)員的外周血中未發(fā)現(xiàn)有梭形細(xì)胞貼壁：動(dòng)員后的外周血中發(fā)現(xiàn)有梭形細(xì)胞貼壁，而且這細(xì)胞可以形成小的集落，但是增殖緩慢，增殖能力有限，不能人量擴(kuò)增。 結(jié)論： 1.利用