兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)復(fù)合藻酸鈣成軟骨實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)等向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)8d、11d、14d、17d、20d后，與藻酸鈣凝膠復(fù)合體外培養(yǎng)，細(xì)胞在三維條件下增殖情況及共同構(gòu)建組織工程化軟骨情況。
　　 方法：穿刺新西蘭大耳白兔股骨抽取骨髓，密度梯度離心法分離、培養(yǎng)BMSCs。將傳至第3代的BMSCs予以含TGF-β1、地塞米松等成份的無血清誘導(dǎo)液定向向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)。根據(jù)不同的誘導(dǎo)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組分成為A、B、C

2、、D、E5組：A組：誘導(dǎo)至第8d；B組：誘導(dǎo)至11d；C組：誘導(dǎo)至14d；D組：誘導(dǎo)至17d；E組：誘導(dǎo)至20d。通過細(xì)胞形態(tài)、TB染色、Ⅱ型膠原免疫組化、培養(yǎng)液內(nèi)多聚蛋白聚糖(AG)含量，比較各實(shí)驗(yàn)組定向誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞情況。分別將以上各組成軟骨細(xì)胞復(fù)合藻酸鈣凝膠，以1×107/ml的密度制作為細(xì)胞-藻酸鈣凝膠珠，繼續(xù)體外培養(yǎng)14d。培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞在藻酸鈣凝膠中生長、增殖情況，并通過Ⅱ型膠原免疫組化、阿利新藍(lán)比色法測定各組Ⅱ型膠原表

3、達(dá)和多聚蛋白聚糖(AG)的含量，綜合比較各實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建組織工程化軟骨的情況。
　　 結(jié)果：密度梯度離心法分離純化的BMSCs定向成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)8d時(shí)形態(tài)有較明顯改變，14d時(shí)具有明顯的軟骨細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)培養(yǎng)液在誘導(dǎo)4d時(shí)即可檢出少量AG，8d時(shí)AG濃度出現(xiàn)明顯升高，并保持緩慢升高至20d。在14d時(shí)，誘導(dǎo)的細(xì)胞爬片TB染色可見異染顆粒；Ⅱ型膠原免疫組化明顯陽性表現(xiàn)。與藻酸鈣復(fù)合后，各組成軟骨細(xì)胞在凝膠3D支架中均保持分裂增殖，AO

4、染色見細(xì)胞能增殖成“葡萄串”樣。各實(shí)驗(yàn)組材料切片Ⅱ型膠原免疫組化均可見陽性表達(dá)，以C組、D組為明顯；AG含量檢測顯示各實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組間AG含量具有差異(p<0.05)，C組、D組均高于陽性對照組，以C組AG含量為最高。
　　 結(jié)論：1.采用密度梯度離心法獲取的兔BMSCs，在體外經(jīng)過14d的定向誘導(dǎo)后基本向軟骨細(xì)胞分化；2.藻酸鈣凝膠與種子細(xì)胞生物相容性良好，可以采用注射方式植入；誘導(dǎo)14d后的成軟骨細(xì)胞在藻酸鈣凝膠內(nèi)增殖良