大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)及體內(nèi)異位成骨的實驗研究.pdf

1、目的： 1．建立大鼠骨髓(bone marrow)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal ste mcells,MSCs)的體外培養(yǎng)體系，為MSCs深入研究提供實驗?zāi)Ｐ停?2．觀察大鼠MSCs在成骨培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特征及體外成骨活性，為其作為骨組織工程種子細(xì)胞提供初步的實驗依據(jù)； 3．構(gòu)建大鼠MSCs與骨支架材料復(fù)合物，觀察大鼠MSCs在同系大鼠體內(nèi)異位成骨能力，初步探討其可能機制，為MSCs作為骨組織工程種子細(xì)

2、胞提供應(yīng)用基礎(chǔ)實驗研究。 方法： 1．大鼠MSCs分離及體外培養(yǎng)：取8w齡大鼠，體重為100g～120g，引頸處死后，無菌條件下取出股骨和脛骨，基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖出骨髓，利用密度為1.077×103g/L的淋巴細(xì)胞分離液分離出大鼠骨髓中單個核細(xì)胞，以含10％FBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素的LG-DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)(37℃，5％CO2)，3d后首次換液，待細(xì)胞長至10～14d達(dá)到70％～80％融合后傳

3、代，倒置相差顯微鏡下對其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察，取傳至第3代的MSCs應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測其表面分子CD44、CD45的表達(dá)情況； 2．取第三代大鼠MSCs，按照5×107/L的細(xì)胞密度制備細(xì)胞爬片，培養(yǎng)3天后除去培養(yǎng)液，加入含10％FBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，10-8mol/L的地塞米松，10mmol/L的β-甘油磷酸鈉，50mg/L的抗壞血酸的LG-DMEM培養(yǎng)液在體外進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)

4、前后形態(tài)學(xué)變化。誘導(dǎo)14天，鈣鈷法檢測堿性磷酸酶表達(dá)；誘導(dǎo)21天，Von-Kossa染色檢測成骨情況，免疫熒光法檢測I型膠原表達(dá)； 3．取第三代大鼠MSCs消化、離心，制成濃度為106細(xì)胞/mL細(xì)胞懸液，與骨支架材料多孔β-磷酸三鈣(β tricalcinm phosphate，β-TCP)立方塊(5mm×5mm×5mm，200～400μm孔徑， 95％多孔性)37℃共孵育2h，獲得MSCs/β-TCP復(fù)合物共32枚，隨機分成兩

5、組，每組16枚，分別以不同培養(yǎng)基培養(yǎng)，第1組為成骨誘導(dǎo)組，采用含10％FBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素，10-8mol/L的地塞米松，10mmol/L的β-甘油磷酸鈉，50mg/L的抗壞血酸的LG-DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；第2組為未誘導(dǎo)組，采用含10％FBS，100mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素的LG-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；另設(shè)第3組對照組，為未與任何細(xì)胞復(fù)合的β-TCP16枚，加入含10％FBS，100mg/L青

6、霉素100mg/L鏈霉素的LG-DMEM培養(yǎng)液。體外復(fù)合培養(yǎng)7d后進(jìn)行體內(nèi)實驗，隨機選取12只SD大鼠(雄性，體重150g～200g)，1％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，于背側(cè)皮下對稱植入同組復(fù)合物4枚，每組四只大鼠，孤養(yǎng)，于6w和14w每組各取出兩只處死后取出復(fù)合物多聚甲醛固定，EDTA脫鈣，乙醇系列脫水，石蠟包埋后切片，HE染色光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色檢測I型膠原表達(dá)； 4．統(tǒng)計學(xué)分析：同一

7、時間點不同組間比較采用單因素方差分析，同一組不同時間點間比較采用t檢驗。 結(jié)果： 1．原代培養(yǎng)細(xì)胞懸浮，以折光性強的圓形細(xì)胞為主，3天首次換液可見貼壁細(xì)胞出現(xiàn)，以小角形多見，其間雜有少量有核淋巴細(xì)胞，均分散生長，出現(xiàn)克隆球樣小團(tuán)簇生長；7～10天后,貼壁細(xì)胞明顯增多，出現(xiàn)成纖維樣細(xì)胞外觀，呈長梭形；14天左右細(xì)胞可達(dá)70％～80％的融合，細(xì)胞排列具有明顯的方向性，呈漩渦狀，傳3代后流式細(xì)胞儀檢測其表面分子CD44表達(dá)陽性

8、，CD45為陰性。 2．利用條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化觀察到細(xì)胞體積減小，立體感增強，大多數(shù)細(xì)胞呈多角形或立方形，細(xì)胞突起互相連結(jié)，重疊生長逐漸堆積形成結(jié)節(jié)狀；誘導(dǎo)第14d鈣鈷法堿性磷酸酶染色，細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞界限清楚，胞漿呈淺灰色，出現(xiàn)棕黑色顆粒，部分融合成塊狀，呈強陽性反應(yīng)；誘導(dǎo)第21d出現(xiàn)致密圓形的礦化結(jié)節(jié)，以圓形多見，經(jīng)銷酸銀染色后礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)黑色；誘導(dǎo)第21d免疫熒光檢測Ⅰ型膠原表達(dá)陽性。 3．

9、體內(nèi)實驗HE染色觀察成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞沿β-TCP空隙生長，排列規(guī)則，進(jìn)行Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色，分別測量Ⅰ型膠原積分光密度(integrated optical density，IOD)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，成骨誘導(dǎo)組6w與未誘導(dǎo)組相比Ⅰ型膠原IOD增高(P=0.034<0.05)、與對照組相比I型膠原IOD增高(P=0.011<0.05)；成骨誘導(dǎo)組14w與對照組比較Ⅰ型膠原IOD增高(P=0.026<0.05)；成骨誘導(dǎo)組6 w與14w比

10、較14w Ⅰ型膠原IOD增高(P=0.028<0.05)；未誘導(dǎo)組6w與14w比較14w Ⅰ型膠原IOD增高(P=0.009<0.05)。 結(jié)論： 1．密度梯度離心法和貼壁法成功進(jìn)行了大鼠MSCs的分離、培養(yǎng)及擴增，獲得無造血干細(xì)胞污染的MSCs。 2．MSCs在體外成骨培養(yǎng)條件下，能表現(xiàn)出成骨樣細(xì)胞的某些生物學(xué)特征，這為進(jìn)一步研究MSCs作為骨組織工程種子細(xì)胞提供初步的實驗依據(jù)。 3．經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后的