成骨生長(zhǎng)肽及其誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制的研究.pdf

1、成骨生長(zhǎng)肽(OsteogenicGrovvthPeptide，OGP)是組蛋白H4基因編碼的一種多肽。研究表明，OGP具有廣泛的成骨和造血活性。體內(nèi) OGP可以刺激骨形成，增加小梁骨密度，促進(jìn)骨折的愈合：體外OGP可以調(diào)節(jié)多種成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，提高堿性磷酸酶活性，促進(jìn)基質(zhì)礦化。OGP還可以刺激造血細(xì)胞的生成，提高骨髓移植的成活率，OGP的造血活性與OGP改善了造血微環(huán)境有關(guān)。推測(cè)OGP的成骨和造血活性可能與骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)

2、胞有關(guān)。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨髓中一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，足骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，在適當(dāng)?shù)臈l件下可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)成造血細(xì)胞生長(zhǎng)、分化必不可少的微環(huán)境，同時(shí)也是成骨祖細(xì)胞的前體細(xì)胞，對(duì)骨髓造血和成骨均具有十分重要的作用。 為了研究OGP的生物學(xué)活性與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的關(guān)系及可能的應(yīng)用前景，本論文從以下幾個(gè)方面作了研究： (1)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)

3、胞(rBMSCs)的分離培養(yǎng)及OGP對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的作用。結(jié)果表明，OGP在低濃度(10-10mol/L、10-11mol/L)時(shí)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有有絲分裂原活性，高濃度(10-8mol/L、10-9mol/L，)時(shí)促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。RT-PCR結(jié)果及基因芯片結(jié)果均表明，OGP促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的早期可能與成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfal無(wú)關(guān)；OGP誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

4、的早期，成骨細(xì)胞特異性表達(dá)的標(biāo)志分子骨鈣素(Osteocalcin)表達(dá)陰性，表明大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還沒(méi)有完成向成骨細(xì)胞的分化。 (2)成骨生長(zhǎng)肽誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因表達(dá)譜變化的研究。通過(guò)博奧27K Rat Genome Array芯片，研究了OGP誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期基因表達(dá)譜的變化。發(fā)現(xiàn)共有145個(gè)差異表達(dá)的基因，其中91個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因，54個(gè)下調(diào)表達(dá)的基因。差異表達(dá)的基因中可能與成骨及造血活性相關(guān)的基因

5、共有35個(gè)：包括4個(gè)血管發(fā)生相關(guān)的基因、9個(gè)骨代謝相關(guān)的基因、14個(gè)炎癥與免疫相關(guān)的基因、8個(gè)細(xì)胞增殖與分化相關(guān)的基因。基因表達(dá)譜芯片結(jié)果為進(jìn)一步研究OGP促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和造血活性的分子機(jī)制建立了很好的基礎(chǔ)。 (3)重組載體轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其成骨分化活性與成骨生長(zhǎng)肽誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化活性的比較。以pEGFP-N1質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建了OGP正義載體和Pre-OGP反義載體，并成功的轉(zhuǎn)染了大鼠

6、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。熒光觀察表明，重組載體可以成功地轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定表明，Pre-OGP反義載體轉(zhuǎn)染的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化活性受到抑制，而OGP正義載體轉(zhuǎn)染的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更易于成骨分化。 (4)成骨生長(zhǎng)肽免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立。為了研究OGP與骨質(zhì)疏松等骨代謝疾病、骨折延遲愈合和骨折不愈合等臨床疾病的關(guān)系，本論文建立了一種OGP的免疫學(xué)檢測(cè)方法。通過(guò)改進(jìn)的免疫學(xué)方法建立了一種可用