NDRG2調節(jié)骨髓間充干細胞成骨成脂分化機制的研究.pdf

1、骨質疏松癥(Osteoporosis)是一種以骨生成和骨吸收平衡破壞為特征的慢性炎癥性疾病。目前,能夠引起骨質疏松發(fā)病的因素有很多,包括年齡,雌激素缺乏和炎癥性疾病等。骨髓間充質干細胞(BMMSCs)作為成骨細胞和骨細胞的前體細胞,其分化能力的變化對骨的生長和發(fā)育有著至關重要的影響。因此,研究骨髓間充質干細胞在疾病中生物學行為的變化及其作用機制,提高其成骨分化的能力,對于治療骨性疾病有著深遠的意義。
　　NDRG2屬于NDRG(T

2、he N-myc downstream regulated gene)家族,是近年來越來越受到關注的一個基因,其在細胞的增殖、分化、凋亡過程中均發(fā)揮著作用,尤其在癌癥發(fā)生過程中的作用被越來越多的文章報道,甚至有學者提出,NDRG2可能將會成為判斷癌癥預后的指標。本課題組前期研究結果和文獻報道均表明,NDRG2能都調節(jié)骨早期的生長和發(fā)育,并且在正常和患有疾病的骨組織中NDRG2的表達有差異,在成骨和破骨細胞中,NDRG2的表達也不同。但是

3、在骨質疏松疾病中,NDRG2是否調控了BMMSCs成骨成脂分化以及如何調控分化,它的表達和功能的變化是否受到其他因素的調節(jié),以及是怎樣調節(jié)的,目前還沒有明確。研究NDRG2對BMMSCs分化能力的調控以及在骨質疏松疾病狀態(tài)下表達和功能的異常,對于探究BMMSCs成骨分化機制以及探索新的治療靶點具有指導意義。
　　研究目的:
　　1.探討NDRG2在BMMSCs成骨分化過程中的表達;
　　2.探討NDRG2調控BMMSC

4、成骨分化的機制;
　　3.探討NDRG2在骨質疏松疾病中表達和功能的異常及其作用機制。
　　研究方法:
　　1.利用密度梯度法分離、純化、培養(yǎng)mBMMSCs,流式細胞技術檢測細胞表面標志物,成骨成脂誘導檢測mBMMSCs的分化能力,RT-PCR檢測成骨成脂誘導后標志性基因的表達。
　　2.利用RT-PCR檢測NDRG2在mBMMSCs成骨成脂分化過程中表達的變化,通過慢病毒轉染技術上調/下調NDRG2的表達,體外

5、檢測NDRG2成骨成脂能力的變化;ALP、茜素紅和油紅O觀察堿性磷酸酶、鈣化結節(jié)和脂滴的形成情況,RT-PCR和WesternBlot檢測成骨標志性基因Runx2、Osterix和PPAR的表達。
　　3.在骨質疏松疾病模型中探索NDRG2調節(jié)mBMSCs的作用機制。分離和培養(yǎng)正常和患有骨質疏松小鼠的BMMSCs,對兩組細胞成骨成脂能力進行比較,檢測兩種細胞中NDRG2的表達差異。體外模擬炎癥環(huán)境,檢測NDRG2的表達,通過相關通

6、路抑制劑的加入,觀察成骨基因的變化,通過NDRG2的變化,尋找參與NDRG2調控BMMSCs分化的信號通路并探索其作用機制。通過慢病毒轉染的方式上調/下調NDRG2的表達,檢測成骨基因表達的差異以及這種差異受外界環(huán)境的影響變化。
　　實驗結果:
　　1.通過分離培養(yǎng)的mBMMSCs表達間充干細胞表面標志物而不表達其他造血系干細胞標志物,成骨成長誘導分化后,ALP,茜素紅,油紅O染色證明其具有成骨成脂分化的能力。
　　2

7、.通過芯片及RT-PCR驗證分析發(fā)現(xiàn),NDRG2在成骨誘導以后表達升高。通過對其功能分析發(fā)現(xiàn),高表達NDRG2能夠抑制BMMSCs的體外成骨分化促進其成脂分化,而下調NDRG2能夠促進BMMSCs的成骨分化抑制其成脂分化。
　　3.骨質疏松小鼠(早衰性和雌激素缺乏性)的骨髓間充質干細胞與正常小鼠的骨髓間充質干細胞相比,其成骨能力下降成脂能力增加;NDRG2在骨質疏松小鼠的BMMSCs表達升高。LiCL,TNF-α抑制BMMSC的分

8、化能力,體外環(huán)境中加入LiCL,NDRG2的表達沒有明顯變化;加入TNF-α,NDRG2的表達下降。通過轉染NDRG2,能夠逆轉TNF-α對BMMSC的作用。
　　結論:
　　1.NDRG2能夠抑制BMMSCs的體外成骨能力促進成脂能力。
　　2.NDRG2在正常和患有骨質疏松癥小鼠中的表達存在差異。
　　3.NDRG2受TNF-α的調節(jié),NDRG2調控BMMSCs分化的過程與NF-κB信號通路有關,與WNT信號