大鼠骨髓基質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及成骨成脂分化研究.pdf

1、目的:骨髓基質(zhì)干細胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)是最常用的骨組織工程種子細胞。具有很強的增值能力，在一定的誘導條件下能夠分化為中胚層起源的組織，如骨、軟骨和脂肪等。為修復(fù)重建由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤等各種原因形成的組織缺損，提供了理想的治療手段，是一項非常具有應(yīng)用前景的技術(shù)。骨髓基質(zhì)干細胞是骨組織工程的良好載體，以其為載體攜帶目的基因神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactor，NGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2

2、（Bonemorphogeneticprotein，BMP2）移植進入骨折大鼠模型以促進骨折的愈合是課題《BMP2和NGF雙基因轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細胞移植治療骨折的實驗研究》(項目編號81160223)的主要研究內(nèi)容。骨髓基質(zhì)干細胞在骨髓中含量極低，僅占骨髓有核細胞總數(shù)0.001％-0.1％，體外培養(yǎng)難度較大。體外分離培養(yǎng)純度高、活力強、生物特性均一的BMSCs，對組織工程及細胞的體內(nèi)、體外實驗顯得至關(guān)重要。建立一套簡單易行有效的骨髓基質(zhì)干

3、細胞的培養(yǎng)、純化、鑒定的方案，并進行細胞形態(tài)學觀察、表面標志物鑒定及多向分化能力檢測。以期進一步了解骨髓基質(zhì)干細胞的生物學特性，為其應(yīng)用于臨床提供可靠的理論依據(jù)。
　　方法:將4周齡健康SD大鼠脫頸處死后，放入75％酒精浸泡約10分鐘，無菌條件下取出股骨和脛骨，將股骨和脛骨表面肌肉及其他軟組織剝離干凈，PBS沖洗后，剪開兩側(cè)骨端，用1ml注射器吸取DMEM低糖培養(yǎng)液，從長骨一端插入注射器沖洗2次，將沖洗后的液體置于15ml無菌試管

4、中，用3ml巴氏吸管適當吹打骨髓細胞。將此懸液置入70mm細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量完全培養(yǎng)基（DMEM-LG培養(yǎng)液+15％胎牛血清+1％青鏈霉素）。放置于37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。通過貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)并將細胞進一步傳代純化，觀察其生長特性。對細胞相關(guān)的性狀進行觀察及分析。繪制生長曲線，將生長狀態(tài)良好的P7代細胞進行流式細胞儀檢測細胞表面標記物CD29、CD45、CD90并作同型對照，取生長狀態(tài)良好的P5代細胞分別向成骨、成脂方向誘

5、導分化并分別進行茜素紅及油紅O染色，觀察誘導結(jié)果。
　　結(jié)果:經(jīng)該方法體外培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs呈集落狀貼壁生長，細胞形態(tài)主要為成纖維樣細胞，顯微鏡下觀察可見細胞成簇生長，類似漩渦狀、魚群狀或菊花瓣狀。P1-P5代BMSCs增殖速度快，細胞形態(tài)穩(wěn)定，生長狀態(tài)較好。其后逐漸減慢，P10代之后細胞形態(tài)明顯老化，細胞邊緣粗糙，包體變大，形狀不規(guī)則。生長曲線顯示骨髓基質(zhì)干細胞符合正常細胞生長特征且生長活躍。用流式細胞儀進行細胞表型鑒定:

6、BMSCs表達CD29和CD90，而不表達CD45，說明本實驗培養(yǎng)的細胞符合大鼠BMSCs的表型特征。將以成骨誘導液誘導培養(yǎng)的BMSCs進行茜素紅染色后可見明顯的鈣結(jié)節(jié)，而對照組未見鈣結(jié)節(jié)。將以成脂誘導液誘導培養(yǎng)的BMSCs進行油紅O染色后可見明顯的脂滴，而對照組不明顯。說明本實驗培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs具有成骨和成脂分化的能力。
　　結(jié)論:本實驗采用的是一種相對簡單易行的骨髓基質(zhì)干細胞分離純化的方法，可獲得純度高，活性好，性狀均