小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨成脂分化的影響及可能機(jī)制探討.pdf

1、研究背景：再生障礙性貧血(再障，Aplastic Anemia，AA)發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，近來逐漸認(rèn)識到免疫機(jī)制紊亂包括T淋巴細(xì)胞活化，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制在再障發(fā)中的作用，目前其已成為再障基礎(chǔ)研究方面一個最活躍的領(lǐng)域。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對再障發(fā)病機(jī)制的研究尚鮮有報(bào)道。
　　紅髓脂肪化是再障特征性病理改變。對于再障骨髓中的骨髓組織減少、脂肪組織增多的原因及作用今年來逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。由于成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞共同來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bo

2、ne marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)，BMMSCs作為骨髓基質(zhì)細(xì)胞的起源細(xì)胞，BMMSCs及其分化成的細(xì)胞在再障發(fā)病過程中的作用逐漸引起人們的重視。
　　目前國內(nèi)外均認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與成脂分化不是彼此孤立的過程，而是存在著相互制約的平衡關(guān)系。目前該領(lǐng)域已成為干細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。大量的研究證實(shí)這兩種分化機(jī)制與多種生長因子、及胞內(nèi)外信號通路緊密相關(guān)。成脂分化的誘導(dǎo)因素常常是成

3、骨分化的抑制因素，反之亦然。如過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(Peroxisome proliferation-activated receptor-gamma, PPAR-γ)是成脂分化的主要的誘導(dǎo)因子，同時它可以抑制細(xì)胞的成骨分化。
　　成脂分化與成骨分化是多種信號通路間相互作用的結(jié)果，包括BMP、Wnt、Hedgehogs，Delta/jagged蛋白、FGF、IGF、以及轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ和Runx2等多條信號通路。目前

4、認(rèn)為在非Wnt途徑中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogeneticproteins，BMPs)途徑具有重要地位。BMPs是研究最早和最有潛力的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞因子，其屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(transform growth factor-β，TGF-β)超家族的成員之一， BMP-2是目前研究的較多且作用明顯的成骨因子。近來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，BMPs可通過MAPKs，PI3K等通路進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不直接

5、依賴轉(zhuǎn)錄因子Smad的激活，其中BMPs-MAPKs通路是通路中重要的一環(huán)。
　　Leptin和Adiponectin是脂肪組織參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的兩個主要的脂肪因子。Leptin對T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞都具有免疫調(diào)節(jié)作用。免疫細(xì)胞受到免疫刺激后，產(chǎn)生細(xì)胞因子(尤其是TNF-α)作用于脂肪細(xì)胞，使其分泌Leptin，從而達(dá)到使免疫信號擴(kuò)大化的目的。Adiponectin是脂肪細(xì)胞表達(dá)最豐的激素。主要在天然免疫效應(yīng)中發(fā)揮作用，

6、能抑制髓單核細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖，抑制巨噬細(xì)胞的活性。
　　那么調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是否可以誘導(dǎo)BMMSCs定向分化，分化方向，可能機(jī)制及作用。我們對此進(jìn)行以下研究，以期從一個新的角度探索再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制。
　　目的：(1)體外分離、培養(yǎng)、鑒定小鼠BMMSCs，并研究其生物學(xué)特點(diǎn)。(2)體外分離、純化、鑒定小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。(3)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨成脂分化的影響及可能機(jī)制。(4)建立免疫相關(guān)骨髓衰竭小鼠模型，輸注

7、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、BMMSCs，觀察其對骨髓脂肪化的影響。
　　方法：(1)貼壁篩選法分離純化BALB/c小鼠BMMSCs，胰酶消化傳代，F(xiàn)CM鑒定細(xì)胞表型，并在特定誘導(dǎo)劑下誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化。(2)磁珠分選法分離純化BALB/c小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀鑒定其免疫表型。(3)將磁珠分選法分離純化的BALB/c小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與BALB/c小鼠BMMSCs共培養(yǎng)72小時，Real-time PCR，We

8、stern Blot檢測BMMSCs成骨分化和脂肪分化相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化;共培養(yǎng)7天后PNPP法測定堿性磷酸酶活性并進(jìn)行堿性磷酸酶染色，EL1SA法和免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行Ⅰ型膠原檢測;共培養(yǎng)14天進(jìn)行油紅O染色檢測脂滴的形成及Von Kossa染色觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成。(4)應(yīng)用SiRNA技術(shù)沉默BMP-2基因，p38MAPK抑制劑SB203580和ERK1/2抑制劑PD98059，PKA抑制劑H-89，Real-time PCR，

9、Western Blot，Elisa，免疫組化方法檢測BMMSCs成骨分化和脂肪分化相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的變化，研究BMP-2，MAPKs，cAMP-PKA通路對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對BMMSCs成骨作用影響。(5)C57BL/6小鼠（父本）和BALB/c小鼠（母本）雜交產(chǎn)生CByB6F1小鼠，將F1小鼠γ射線亞致死量照射(4.5Gy)后尾靜脈注射母本淋巴細(xì)胞，建立免疫相關(guān)骨髓衰竭動物模型。比較輸注BMMSCs，輸注調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，輸注調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

10、和BMMSCs共同輸注，空白對照，模型組這五組對骨髓脂肪化的影響。記錄白細(xì)胞，紅細(xì)胞，血小板及血紅蛋白的變化，股骨切片HE染色觀察模型小鼠骨髓脂肪化。
　　結(jié)果：(1) BMMSCs呈梭形、長梭形或三角形，細(xì)胞排列整齊，低倍鏡下可呈旋渦狀或平行狀。FCM檢測BMMSCs高表達(dá)CD44，CD73，CD90和CD105，低表達(dá)或不表達(dá)CD14，CD34，CD45及HLA-DR。在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，BMMSCs能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟

11、骨細(xì)胞分化。(2)磁珠純化分離的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)CD4，CD25和Foxp3。(3)體外培養(yǎng)，BALB/c小鼠BMMSCs與純化的BALB/c小鼠脾臟的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞按1∶5比例共培養(yǎng)72小時，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以明顯上調(diào)BMMSCs成骨因子(BMP-2、OSX、OCN)在基因和蛋白水平的表達(dá)，以BMP-2明顯，促進(jìn)堿性磷酸酶(AKP)和Ⅰ型膠原的表達(dá)，促進(jìn)AKP活性;減少成脂因子(Adiponectin)在基因和蛋白水平的表達(dá);與正常淋巴細(xì)

12、胞共培養(yǎng)相比可以顯著減少PPAR-γ，Leptin的在基因和蛋白水平的表達(dá);加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基后可促進(jìn)鈣化結(jié)節(jié)的形成，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基后可抑制脂滴的形成。(4)應(yīng)用SiRNA技術(shù)沉默BMMSCs的BMP-2基因，Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)成骨基因OCN、OSX的表達(dá)明顯減少，成脂基因Adiponectin、PPAR-γ基因明顯增加。Western Blot檢測蛋白表達(dá)也有近似的趨勢。Treg細(xì)胞作用組p38MARK，ERK1/

13、2的磷酸化水平增高，JNK磷酸化無明顯變化，應(yīng)用p38MAPK抑制劑SB203580和/或ERK1/2抑制劑PD98059，Ⅰ型膠原和堿性磷酸酶的表達(dá)明顯受抑，加入成骨誘導(dǎo)基后鈣化結(jié)節(jié)形成受抑，骨橋素(OPN)、骨鈣素(OCN)表達(dá)減少。Treg細(xì)胞作用組cAMP、蛋白激酶A(PKA)水平均較對照組高，應(yīng)用PKA抑制劑H-89，Treg細(xì)胞促進(jìn)Ⅰ型膠原形成的作用被明顯抑制，ELISA法和免疫組化法得到類似結(jié)果。(5) CByB6F1小鼠

14、亞致死量照射后，骨髓衰竭為可逆性，外周血象在第10天開始恢復(fù)，約6周恢復(fù)至正常水平，而亞致死量照射后經(jīng)尾靜脈注射母本小鼠淋巴細(xì)胞的小鼠，外周血象降低為不可逆性，造成不可逆性免疫相關(guān)骨髓衰竭。骨髓病理學(xué)檢查證實(shí)骨髓衰竭，免疫相關(guān)骨髓衰竭組小鼠髓腔空虛，脂肪組織明顯增多，而正常對照組和單獨(dú)照射組骨髓內(nèi)均無明顯脂肪組織形成。骨髓脂肪化改善效果，共同輸注Treg細(xì)胞和BMMSCs組和輸注BMMSCs組，與輸注Treg細(xì)胞組有顯著差異。
　

15、　結(jié)論：(1)全骨髓貼壁篩選培養(yǎng)法可簡便、高效分離、純化BMMSCs。所獲得的細(xì)胞具有BMMSCs特征性的細(xì)胞表型及向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化能力。(2)磁珠純化小鼠脾細(xì)胞可得到足量的符合免疫表型的Treg細(xì)胞。(3)小鼠Treg細(xì)胞能促進(jìn)BMMSCs成骨相關(guān)基因(BMP-2，OCN，OSX)的表達(dá)，抑制成脂相關(guān)基因(adiponectin，PPAR-γ，Leptin)的表達(dá)。(4)小鼠Treg細(xì)胞通過BMP-MARKs途徑，c