替諾福韋酯對人骨髓間充質干細胞成骨分化的影響及其機制探討.pdf

1、目的:
　　 通過檢測替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)對體外培養(yǎng)條件下人骨髓間充質干細胞（human mesenchymal stem cells-bone marrow，hBMSC）成骨分化的影響，及TDF干預下成骨譜系細胞Wnt/β-catenin信號通路相關因子的基因表達，探索TDF影響人骨代謝的機制。
　　 方法:
　　 第一部分1、人骨髓間充質干細胞體外培

2、養(yǎng)與成骨分化誘導:體外培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞，給予成骨分化培養(yǎng)基，觀察細胞增殖和分化情況，應用堿性磷酸酶染色和鈣茜素紅染色檢測人骨髓間充質干細胞成骨細胞分化的過程。2、TDF對人骨髓間充質干細胞成骨分化過程中細胞增殖和凋亡的影響:根據(jù)不同濃度TDF處理分組:0nM TDF組，50nM TDF組，500nM TDF組，5000nM TDF組。MTT法檢測各組細胞在培養(yǎng)1-7天的增殖情況;用Annexin V&PI染色法和TUNEL法檢測各

3、組細胞凋亡情況。3、替諾福韋酯對人骨髓間充質干細胞成骨分化的影響:在誘導培養(yǎng)的第3、7、9、10天進行堿性磷酸酶染色，在第10、14、21、28天進行鈣茜素紅染色以檢測各組細胞成骨分化過程中的礦化狀況。4、替諾福韋酯對人骨髓間充質干細胞成骨分化過程中部分細胞因子基因表達的影響:應用realtime-PCR方法檢測各組細胞中堿性磷酸酶、Ⅰ-型膠原、骨保護素和核因子κ B活化因子受體配體(receptor activator for nuc

4、lear factor-κB Ligand，RANKL)的基因表達水平;分析TDF干預下人源成骨譜系細胞分泌功能的變化。
　　 第二部分TDF影響人骨髓間充質干細胞成骨分化和功能的機制研究:細胞分組同實驗二，應用realtime-PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路相關因子的基因表達水平，分析TDF對人成骨細胞分化和功能的影響是否通過Wnt/β-catenin經(jīng)典信號介導，以及受TDF干擾的關鍵細胞因子。
　　

5、結果：
　　 第一部分1、人骨髓間充質干細胞經(jīng)體外誘導培養(yǎng)可表現(xiàn)出成骨細胞特征:人骨髓間充質干細胞可經(jīng)間充質干細胞-成骨分化培養(yǎng)基誘導表現(xiàn)出成骨細胞特性，堿性磷酸酶染色陽性、茜素紅染色可見特征性鈣結節(jié)形成。2、50nM-500nM TDF對hBMSC增殖和凋亡以及hBMSC分化的成骨譜系細胞增殖和凋亡無明顯影響:①50nM TDF和500nM TDF對人骨髓間充質干細胞以及人骨髓間充質干細胞成骨分化過程中細胞增殖、凋亡無明顯影響

6、;②5000nM TDF顯著抑制人骨髓間充質干細胞增殖，也抑制人骨髓間充質干細胞來源的成骨譜系細胞增殖。3、50nM-500nMTDF干擾hBMSC的成骨分化過程:①500nM TDF干擾人骨髓間充質干細胞的成骨分化過程，表現(xiàn)為堿性磷酸酶染色陽性細胞百分比減少（17.50±4.40％vs.12.40±2.70％，P=0.005），染色減弱;胞外基質礦化異常，茜素紅染色鈣結節(jié)多為條索狀，邊緣模糊，很少圓形、類圓形）;②50nM TDF對人

7、骨髓間充質干細胞成骨分化過程中胞外基質礦化也有干擾，但作用弱于500nM TDF。4、TDF干擾hBMSC成骨分化過程中細胞因子的基因表達:在人骨髓間充質干細胞成骨分化過程中，50nMTDF(8.15±0.7 vs.6.89±0.35,P=0.001)和500nM TDF(8.15±0.70 vs.4.64±0.45,P=0.000)抑制堿性磷酸酶基因表達，也抑制Ⅰ-型膠原的基因表達(9.28±0.26 vs.2.81±0.17,P=0

8、.000;9.28±0.26 vs.1.98±0.15, P=0.000);而RANKL mRNA在50nMTDF組（4.98±0.20 vs.7.89±0.41,P=0.00）和500nM TDF組(4.98±0.20 vs.6.82±0.03，P=0.000)表達水平均升高。
　　 第二部分50nM TDF和500nM TDF干擾人骨髓間充質干細胞成骨分化過程中LRP5 mRNA表達;50nM TDF(5.01±1.69 v

9、s.2.31±0.24,P=0.001)和500nM TDF(5.01±1.69 vs.3.39±0.79，P=0.021)均降低β-catenin mRNA表達。
　　 結論：
　　 1、替諾福韋酯對人骨代謝的影響可能是通過抑制成骨細胞的分化過程以及成骨細胞功能實現(xiàn)的;
　　 2、Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路參與介導替諾福韋酯對成骨細胞分化和功能的干擾作用，尤其是LRP5和β-catenin mRNA