替諾福韋酯對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　 通過(guò)檢測(cè)替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)對(duì)體外培養(yǎng)條件下人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells-bone marrow，hBMSC）成骨分化的影響，及TDF干預(yù)下成骨譜系細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子的基因表達(dá)，探索TDF影響人骨代謝的機(jī)制。
　　 方法:
　　 第一部分1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培

2、養(yǎng)與成骨分化誘導(dǎo):體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，給予成骨分化培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞增殖和分化情況，應(yīng)用堿性磷酸酶染色和鈣茜素紅染色檢測(cè)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化的過(guò)程。2、TDF對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中細(xì)胞增殖和凋亡的影響:根據(jù)不同濃度TDF處理分組:0nM TDF組，50nM TDF組，500nM TDF組，5000nM TDF組。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞在培養(yǎng)1-7天的增殖情況;用Annexin V&PI染色法和TUNEL法檢測(cè)各

3、組細(xì)胞凋亡情況。3、替諾福韋酯對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響:在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第3、7、9、10天進(jìn)行堿性磷酸酶染色，在第10、14、21、28天進(jìn)行鈣茜素紅染色以檢測(cè)各組細(xì)胞成骨分化過(guò)程中的礦化狀況。4、替諾福韋酯對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中部分細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響:應(yīng)用realtime-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞中堿性磷酸酶、Ⅰ-型膠原、骨保護(hù)素和核因子κ B活化因子受體配體(receptor activator for nuc

4、lear factor-κB Ligand，RANKL)的基因表達(dá)水平;分析TDF干預(yù)下人源成骨譜系細(xì)胞分泌功能的變化。
　　 第二部分TDF影響人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和功能的機(jī)制研究:細(xì)胞分組同實(shí)驗(yàn)二，應(yīng)用realtime-PCR檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子的基因表達(dá)水平，分析TDF對(duì)人成骨細(xì)胞分化和功能的影響是否通過(guò)Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)介導(dǎo)，以及受TDF干擾的關(guān)鍵細(xì)胞因子。
　　

5、結(jié)果：
　　 第一部分1、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)可表現(xiàn)出成骨細(xì)胞特征:人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可經(jīng)間充質(zhì)干細(xì)胞-成骨分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)表現(xiàn)出成骨細(xì)胞特性，堿性磷酸酶染色陽(yáng)性、茜素紅染色可見(jiàn)特征性鈣結(jié)節(jié)形成。2、50nM-500nM TDF對(duì)hBMSC增殖和凋亡以及hBMSC分化的成骨譜系細(xì)胞增殖和凋亡無(wú)明顯影響:①50nM TDF和500nM TDF對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中細(xì)胞增殖、凋亡無(wú)明顯影響

6、;②5000nM TDF顯著抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，也抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的成骨譜系細(xì)胞增殖。3、50nM-500nMTDF干擾hBMSC的成骨分化過(guò)程:①500nM TDF干擾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過(guò)程，表現(xiàn)為堿性磷酸酶染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比減少（17.50±4.40％vs.12.40±2.70％，P=0.005），染色減弱;胞外基質(zhì)礦化異常，茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)多為條索狀，邊緣模糊，很少圓形、類圓形）;②50nM TDF對(duì)人

7、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中胞外基質(zhì)礦化也有干擾，但作用弱于500nM TDF。4、TDF干擾hBMSC成骨分化過(guò)程中細(xì)胞因子的基因表達(dá):在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中，50nMTDF(8.15±0.7 vs.6.89±0.35,P=0.001)和500nM TDF(8.15±0.70 vs.4.64±0.45,P=0.000)抑制堿性磷酸酶基因表達(dá)，也抑制Ⅰ-型膠原的基因表達(dá)(9.28±0.26 vs.2.81±0.17,P=0

8、.000;9.28±0.26 vs.1.98±0.15, P=0.000);而RANKL mRNA在50nMTDF組（4.98±0.20 vs.7.89±0.41,P=0.00）和500nM TDF組(4.98±0.20 vs.6.82±0.03，P=0.000)表達(dá)水平均升高。
　　 第二部分50nM TDF和500nM TDF干擾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中LRP5 mRNA表達(dá);50nM TDF(5.01±1.69 v

9、s.2.31±0.24,P=0.001)和500nM TDF(5.01±1.69 vs.3.39±0.79，P=0.021)均降低β-catenin mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1、替諾福韋酯對(duì)人骨代謝的影響可能是通過(guò)抑制成骨細(xì)胞的分化過(guò)程以及成骨細(xì)胞功能實(shí)現(xiàn)的;
　　 2、Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路參與介導(dǎo)替諾福韋酯對(duì)成骨細(xì)胞分化和功能的干擾作用，尤其是LRP5和β-catenin mRNA