鈦表面改性及其對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響.pdf

1、由于鈦及鈦合金優(yōu)越的生物相容性和力學(xué)性能,被廣泛應(yīng)用于骨科、牙科等領(lǐng)域。然而由于鈦及鈦合金表面的生物惰性，缺乏誘導(dǎo)骨生成的潛能，且無法與周圍骨組織形成有效的骨鍵合。因此本文以鈦表面二氧化鈦納米管為儲存器，采用多種骨生長相關(guān)生物因子對鈦進(jìn)行表面改性，通過成骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)實驗，評價表面改性鈦的成骨能力，研究其作用機(jī)理。本工作可豐富骨植入材料-組織間相互作用理論，并為開發(fā)骨誘導(dǎo)性金屬材料提供新的實驗基礎(chǔ)。
　　本論文內(nèi)容分

2、為四個部分。為了研究不同納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和成骨生長肽(osteogenic growth peptide，OGP)對成骨細(xì)胞的影響，利用陽極氧化方法在鈦表面構(gòu)建不同管徑的二氧化鈦納米管，并選取100nm直徑的納米管吸附OGP，進(jìn)行成骨細(xì)胞的培養(yǎng)。X射線能量色散譜儀(Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy，EDS)和X射線光電子能譜(X-ray Photoelectron Spectroscopy，XPS)分

3、析證實OGP成功地裝載到了材料表面和內(nèi)部。體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)實驗表明，除納米管管徑尺寸對成骨細(xì)胞行為有影響外，吸附了OGP的納米管既有利于成骨細(xì)胞粘附、增殖，又對細(xì)胞的分化起到了促進(jìn)作用。因而，采用鈦表面吸附OGP方法簡便，且更有利于成骨細(xì)胞生長，具有促進(jìn)骨生成的能力。
　　其次，以間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)培養(yǎng)基中常用誘導(dǎo)因子改性鈦表面納米管層，研究攜載不同誘導(dǎo)因子的納米管對MSCs的影響。在真空條件下，選用100nm管徑的納米管層

4、分別吸附地塞米松、β-甘油磷酸鈉、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和OGP，然后進(jìn)行體外MSCs的培養(yǎng)。結(jié)果表明，四種成分均成功的吸附在納米管表面。納米管作為儲存器攜載β-甘油磷酸鈉的材料在細(xì)胞培養(yǎng)初期不利于細(xì)胞的粘附，但提高了部分成骨相關(guān)基因的表達(dá);攜載地塞米松的納米管對細(xì)胞前期的增殖有促進(jìn)作用，提高了Ⅰ型膠原蛋白(Col-1)和骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)量和鈣含量;以O(shè)GP改性

5、有利于細(xì)胞的粘附和增殖，但對干細(xì)胞的成骨分化沒有明顯影響;而攜載了BMP-2的納米管有利于細(xì)胞的粘附和增殖，且堿性磷酸酶(alkline phosphatase，ALP)活性、兩種特異性蛋白、鈣含量和成骨相關(guān)基因的表達(dá)都比其他組要高。表明材料表面不同的誘導(dǎo)因子可能經(jīng)由不同的途徑作用于MSCs的成骨分化過程，從而顯示出不同的促進(jìn)能力。其中，鈦表面納米管攜載BMP-2對干細(xì)胞的增殖和分化具有最為明顯的促進(jìn)作用。
　　再次，研究不同管徑

6、的納米管層裝載BMP-2后對MSCs成骨分化的影響。XPS和EDS分析發(fā)現(xiàn)BMP-2成功裝載到了納米管的表面和內(nèi)部。釋放研究表明，100nm納米管試樣中BMP-2的釋放量要大于另外兩組管徑試樣。攜載了BMP-2的50nm納米管較其他組更能促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖，100nm納米管攜載BMP-2后更有利于細(xì)胞遷移，提高了細(xì)胞的ALP活性、特異性蛋白表達(dá)、成骨相關(guān)基因和鈣含量。因此，100nm管徑納米管的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和BMP-2協(xié)同作用更有效地促進(jìn)了

7、MSCs的成骨分化。
　　最后，在裝載BMP-2的納米管上，引入殼聚糖(CS)、BMP-2兩種陽離子型聚電解質(zhì)和一種陰離子型聚電解質(zhì)DNA，用層層組裝的方法制備多層膜，以實現(xiàn)BMP-2的控制釋放及長效作用。掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)、XPS、接觸角和多層膜降解實驗結(jié)果顯示，CS、BMP-2、DNA通過靜電吸附形成了100nm厚的多層膜。仿生條件下的降解與釋放實驗表明，14d時

8、，多層膜的降解已經(jīng)使納米管基底裸露出來;到21d時，大部分的多層膜已經(jīng)降解;細(xì)胞培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示，多層膜不利于細(xì)胞初期的粘附但利于細(xì)胞的增殖;ALP測定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析、Col-1和OPN的染色結(jié)果表明，多層膜能顯著提高M(jìn)SCs的成骨分化，且隨著多層膜的降解，管內(nèi)BMP-2和納米管能夠協(xié)同地持續(xù)促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化。因此，鈦表面納米結(jié)構(gòu)化與層層組裝技術(shù)結(jié)合，是制備骨誘導(dǎo)金屬材料的簡便而有效的手段，也可為其他藥物控釋系統(tǒng)的研