間充質(zhì)干細胞成骨分化潛能及其對骨片移植的免疫調(diào)控.pdf

1、間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類能夠自我更新，具有多向分化潛能，最早從骨髓分離的成體干細胞。它能夠向脂肪、成骨和軟骨細胞分化，也可以跨胚層分化，是組織工程的一個理想種子細胞。大量的研究報道稱，MSCs能夠用于心肌組織，損傷的骨組織、軟骨組織和肌腱的修復和再生。
　　 MSCs具有低免疫原性，能夠提供細胞因子和生長因子支持造血干細胞的擴增和成熟。另外，它能夠與免疫系統(tǒng)相互作用，具有免疫抑

2、制作用。將體外培養(yǎng)的MSCs輸入體內(nèi)后，可誘導外周免疫耐受，并且可遷移到受損組織，降低促炎癥因子的表達，促進受損細胞的存活。令人關注的是，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠促進異體皮膚移植的存活，降低了移植物抗宿主疾病(GVHD)的發(fā)病率和疾病進程。
　　 本研究應用膠原酶消化骨片的方法成功分離小鼠MSCs，并在體外進行培養(yǎng)。這種方法獲得的MSCs具有均一的表型，不表達造血和內(nèi)皮的標記分子CD11b，CD31，CD45，CD34，不表達

3、免疫共刺激分子CD80和CD86，不表達MHCⅡ類分子，但是中度表達MHCⅠ類分子，表達一些細胞粘附分子CD29，CD44，CD105和干細胞標志Sca-1的細胞。而且其具有塑料貼壁性，能夠向脂肪、成骨和軟骨誘導分化，符合MSCs的鑒定標準。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK，Mitogen-activated protein kinase)信號通路是調(diào)控細胞增殖分化的經(jīng)典信號通路。雖然已有報道表明MAPK調(diào)節(jié)人來源的MSCs

4、或間質(zhì)細胞系等向成骨細胞分化，但所得結論之間存在著很大差別。而MAPK各條通路中，特別是ERK1/2和JNK通路，究竟在小鼠MSCs向成骨分化中起什么作用，目前還沒有定論。為此，我們針對ERK1/2(extracellularsignal-regulated kinase)，JNK(c-Jun N-terminal kinase)和p38如何參與小鼠MSCs向成骨分化進行了一系列研究。實驗證明，在MSCs向成骨誘導分化中，ERK1/2、

5、JNK和p38通路均發(fā)生活化；加入ERK1/2通路阻斷劑PD98059后，堿性磷酸酶(ALP)的表達在誘導早期有顯著提高，而后無顯著改變；加入JNK通路抑制劑JNKⅡ后不影響ALP和鈣的沉積；而加入p38通路抑制劑SB203580后，可顯著抑制MSCs中ALP的表達和鈣的沉積。通路抑制劑對MSCs向成骨分化的影響呈劑量依賴性。另一方面的結果表明，p38通路在MSCs向成骨分化中起正調(diào)控作用，ERK通路可能在早期起負調(diào)控作用，而JNK通路

6、在分化過程中的作用不顯著?；罨腡細胞也能夠促進MSCs向成骨分化，并且在一定范圍內(nèi)，隨著T細胞與MSCs的比例增加，堿性磷酸酶(ALP)的活性也隨之增強。而且MAPK通路也參與了活化的T細胞誘導MSCs向成骨分化的調(diào)控，在MSCs與活化的T細胞共培養(yǎng)體系中加入p38通路抑制劑SB203580后，顯著抑制MSCs中ALP的表達，加入ERK1/2和JNK通路抑制劑后不影響MSCs ALP的表達。
　　 支架、細胞、因子是骨組織工程

7、中研究的三大問題，支架材料作為研究的基礎，必須具有良好的生物安全性和組織相容性，并且能夠創(chuàng)造一種微環(huán)境，以利于細胞的粘附、增殖和功能的發(fā)揮。聚酯和鈣磷鹽是目前骨組織工程中研究的最多的支架材料。本研究中采用的兩種材料，PLGA和PLGA/TCP。一方面觀察兩種材料在體外與MSCs的粘附特性；另一方面觀察將復合骨片移植到體內(nèi)后所產(chǎn)生的免疫反應。本實驗將不同MSCs細胞濃度接種到兩種生物材料上，觀察到當接種濃度為2×105時接種率最高，并且在

8、此濃度下誘導14天時，ALP活性相對較高。用統(tǒng)計學方法分析兩種材料的接種率和ALP活性表達之間沒有顯著性差異，可能這兩種材料的結構對細胞的支撐作用相似。但是在實驗中發(fā)現(xiàn)，PLGA/TCP比單一的PLGA擁有更高的強度適應于體內(nèi)移植。
　　 已有研究表明自體MSCs與生物材料相結合，在體內(nèi)移植后可以向成骨、軟骨和脂肪組織等分化，但是異體MSCs的應用也是必需的，例如，在一些急性臨床條件下需要大量的細胞時，而自體MSCs可能由于時間

9、短無法滿足需求。而且生物工程骨移植后成功率也是潛在的問題。有報道稱體外實驗證明MSCs分化后與MSCs具有相似的免疫調(diào)節(jié)功能，但是體內(nèi)移植后這種免疫調(diào)節(jié)是否存在局限性，而且材料降解的產(chǎn)物可能會影響到異體移植骨片在體內(nèi)的存活，引發(fā)機體對移植物的排斥反應。因此我們將與復合骨片中相同來源的MSCs靜脈輸注給受體小鼠，觀察其是否能夠降低異體移植所發(fā)生的免疫排斥反應。結果表明，移植1周時從病理切片觀察到復合骨片移植體區(qū)域與單純材料移植體區(qū)域有較多

10、的炎性細胞浸潤，但是尾靜脈注射異體MSC后觀察到炎性細胞浸潤要較少，脾小結也較小較少。CD69是T細胞早期的活化標志，參與T細胞的增殖。我們在實驗中觀察到單純材料和復合骨片移植后，動物體內(nèi)CD69CD3在CD3+T細胞中的比例較高，而輸注MSCs后顯著降低了CD69的活化比例。CD8+T細胞又稱為細胞毒性T淋巴細胞，能夠特異性直接殺傷靶細胞。實驗結果顯示，在復合骨片移植的同時輸注MSCs后，在24h后觀察到CD4與CD8的比例要顯著高于

11、異體復合骨片移植組，提示免疫應答的正調(diào)節(jié)占優(yōu)勢，因此，尾靜脈輸注MSCs可能有利于異體復合骨片在體內(nèi)的生存。資料顯示，MSCs能夠下調(diào)DC1對TNF-α的表達，抑制B細胞和NK細胞的活性；下調(diào)Th1對IL-2的分泌，而IL-2是介導細胞排斥的一個重要因子；上調(diào)Th2對IL-4、IL-10的表達，從而誘導免疫耐受。在實驗中采用RT-PCR的方法檢測了各種細胞因子在mRNA水平上的表達情況，發(fā)現(xiàn)給小鼠進行異體復合骨片移植的同時輸注MSCs后