間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化潛能及其對(duì)骨片移植的免疫調(diào)控.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類能夠自我更新，具有多向分化潛能，最早從骨髓分離的成體干細(xì)胞。它能夠向脂肪、成骨和軟骨細(xì)胞分化，也可以跨胚層分化，是組織工程的一個(gè)理想種子細(xì)胞。大量的研究報(bào)道稱，MSCs能夠用于心肌組織，損傷的骨組織、軟骨組織和肌腱的修復(fù)和再生。
　　 MSCs具有低免疫原性，能夠提供細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子支持造血干細(xì)胞的擴(kuò)增和成熟。另外，它能夠與免疫系統(tǒng)相互作用，具有免疫抑

2、制作用。將體外培養(yǎng)的MSCs輸入體內(nèi)后，可誘導(dǎo)外周免疫耐受，并且可遷移到受損組織，降低促炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)受損細(xì)胞的存活。令人關(guān)注的是，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠促進(jìn)異體皮膚移植的存活，降低了移植物抗宿主疾病(GVHD)的發(fā)病率和疾病進(jìn)程。
　　 本研究應(yīng)用膠原酶消化骨片的方法成功分離小鼠MSCs，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)。這種方法獲得的MSCs具有均一的表型，不表達(dá)造血和內(nèi)皮的標(biāo)記分子CD11b，CD31，CD45，CD34，不表達(dá)

3、免疫共刺激分子CD80和CD86，不表達(dá)MHCⅡ類分子，但是中度表達(dá)MHCⅠ類分子，表達(dá)一些細(xì)胞粘附分子CD29，CD44，CD105和干細(xì)胞標(biāo)志Sca-1的細(xì)胞。而且其具有塑料貼壁性，能夠向脂肪、成骨和軟骨誘導(dǎo)分化，符合MSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK，Mitogen-activated protein kinase)信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的經(jīng)典信號(hào)通路。雖然已有報(bào)道表明MAPK調(diào)節(jié)人來源的MSCs

4、或間質(zhì)細(xì)胞系等向成骨細(xì)胞分化，但所得結(jié)論之間存在著很大差別。而MAPK各條通路中，特別是ERK1/2和JNK通路，究竟在小鼠MSCs向成骨分化中起什么作用，目前還沒有定論。為此，我們針對(duì)ERK1/2(extracellularsignal-regulated kinase)，JNK(c-Jun N-terminal kinase)和p38如何參與小鼠MSCs向成骨分化進(jìn)行了一系列研究。實(shí)驗(yàn)證明，在MSCs向成骨誘導(dǎo)分化中，ERK1/2、

5、JNK和p38通路均發(fā)生活化；加入ERK1/2通路阻斷劑PD98059后，堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)在誘導(dǎo)早期有顯著提高，而后無顯著改變；加入JNK通路抑制劑JNKⅡ后不影響ALP和鈣的沉積；而加入p38通路抑制劑SB203580后，可顯著抑制MSCs中ALP的表達(dá)和鈣的沉積。通路抑制劑對(duì)MSCs向成骨分化的影響呈劑量依賴性。另一方面的結(jié)果表明，p38通路在MSCs向成骨分化中起正調(diào)控作用，ERK通路可能在早期起負(fù)調(diào)控作用，而JNK通路

6、在分化過程中的作用不顯著?；罨腡細(xì)胞也能夠促進(jìn)MSCs向成骨分化，并且在一定范圍內(nèi)，隨著T細(xì)胞與MSCs的比例增加，堿性磷酸酶(ALP)的活性也隨之增強(qiáng)。而且MAPK通路也參與了活化的T細(xì)胞誘導(dǎo)MSCs向成骨分化的調(diào)控，在MSCs與活化的T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中加入p38通路抑制劑SB203580后，顯著抑制MSCs中ALP的表達(dá)，加入ERK1/2和JNK通路抑制劑后不影響MSCs ALP的表達(dá)。
　　 支架、細(xì)胞、因子是骨組織工程

7、中研究的三大問題，支架材料作為研究的基礎(chǔ)，必須具有良好的生物安全性和組織相容性，并且能夠創(chuàng)造一種微環(huán)境，以利于細(xì)胞的粘附、增殖和功能的發(fā)揮。聚酯和鈣磷鹽是目前骨組織工程中研究的最多的支架材料。本研究中采用的兩種材料，PLGA和PLGA/TCP。一方面觀察兩種材料在體外與MSCs的粘附特性；另一方面觀察將復(fù)合骨片移植到體內(nèi)后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)將不同MSCs細(xì)胞濃度接種到兩種生物材料上，觀察到當(dāng)接種濃度為2×105時(shí)接種率最高，并且在

8、此濃度下誘導(dǎo)14天時(shí)，ALP活性相對(duì)較高。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析兩種材料的接種率和ALP活性表達(dá)之間沒有顯著性差異，可能這兩種材料的結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的支撐作用相似。但是在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PLGA/TCP比單一的PLGA擁有更高的強(qiáng)度適應(yīng)于體內(nèi)移植。
　　 已有研究表明自體MSCs與生物材料相結(jié)合，在體內(nèi)移植后可以向成骨、軟骨和脂肪組織等分化，但是異體MSCs的應(yīng)用也是必需的，例如，在一些急性臨床條件下需要大量的細(xì)胞時(shí)，而自體MSCs可能由于時(shí)間

9、短無法滿足需求。而且生物工程骨移植后成功率也是潛在的問題。有報(bào)道稱體外實(shí)驗(yàn)證明MSCs分化后與MSCs具有相似的免疫調(diào)節(jié)功能，但是體內(nèi)移植后這種免疫調(diào)節(jié)是否存在局限性，而且材料降解的產(chǎn)物可能會(huì)影響到異體移植骨片在體內(nèi)的存活，引發(fā)機(jī)體對(duì)移植物的排斥反應(yīng)。因此我們將與復(fù)合骨片中相同來源的MSCs靜脈輸注給受體小鼠，觀察其是否能夠降低異體移植所發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果表明，移植1周時(shí)從病理切片觀察到復(fù)合骨片移植體區(qū)域與單純材料移植體區(qū)域有較多

10、的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但是尾靜脈注射異體MSC后觀察到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)要較少，脾小結(jié)也較小較少。CD69是T細(xì)胞早期的活化標(biāo)志，參與T細(xì)胞的增殖。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到單純材料和復(fù)合骨片移植后，動(dòng)物體內(nèi)CD69CD3在CD3+T細(xì)胞中的比例較高，而輸注MSCs后顯著降低了CD69的活化比例。CD8+T細(xì)胞又稱為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，能夠特異性直接殺傷靶細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在復(fù)合骨片移植的同時(shí)輸注MSCs后，在24h后觀察到CD4與CD8的比例要顯著高于

11、異體復(fù)合骨片移植組，提示免疫應(yīng)答的正調(diào)節(jié)占優(yōu)勢(shì)，因此，尾靜脈輸注MSCs可能有利于異體復(fù)合骨片在體內(nèi)的生存。資料顯示，MSCs能夠下調(diào)DC1對(duì)TNF-α的表達(dá)，抑制B細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性；下調(diào)Th1對(duì)IL-2的分泌，而IL-2是介導(dǎo)細(xì)胞排斥的一個(gè)重要因子；上調(diào)Th2對(duì)IL-4、IL-10的表達(dá)，從而誘導(dǎo)免疫耐受。在實(shí)驗(yàn)中采用RT-PCR的方法檢測(cè)了各種細(xì)胞因子在mRNA水平上的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)給小鼠進(jìn)行異體復(fù)合骨片移植的同時(shí)輸注MSCs后