高糖環(huán)境下NCoR siRNA對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化調(diào)控的實驗研究.pdf

1、研究背景:骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)具有分化成不同細胞組織的能力，其中包括成骨細胞，脂肪細胞，軟骨細胞以及肌細胞。體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的相關研究中發(fā)現(xiàn)，在合適的環(huán)境和條件下，骨髓間充質(zhì)干細胞能夠在體外進行34-42次的分裂增殖，增殖過程中始終保持梭形并呈漩渦狀排列。不僅如此，骨髓間充質(zhì)干細胞在冷凍保存進行復蘇后，仍然具備干細胞的特性。BMSCs不僅存在于骨髓中，還游離于骨組織外。當其在適當信號刺激時，可游離出骨組織，到達效應靶器

2、官組織中，這種生物學行為叫“歸巢”。在適當?shù)纳锖臀锢硪蛩嘏c足夠的特異性信號傳導的存在，BMSCs能夠分化成所需的特定細胞組織。由于這些性質(zhì)，BMSC已經(jīng)成為肌肉骨骼組織再生治療研究的主要細胞來源。
　　BMSCs分化成骨細胞受細胞外信號和轉(zhuǎn)錄水平的級聯(lián)放大調(diào)控，這需要大量基因表達之間的精細時空調(diào)節(jié)。研究表明，原發(fā)性成骨分化誘導主要由Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）關鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。Runx2激活和調(diào)節(jié)成骨作為許多信號通路的靶

3、基因，包括但不限于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-b1)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，Wingless type1(Wnt)，Hedgehog(HH)和(Nel)樣蛋白1型(NELL-1)。誘導后，成骨細胞分化下游的前成骨細胞分化成成骨細胞，成骨細胞成熟和基質(zhì)礦化的過程受其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，包括Osterix，BSP，OCN和OPN。這個過程也受到許多其他物理和生物因素的影響，其中大多數(shù)已經(jīng)在體外證明，并且仍然在仔細審查。
　　影響B(tài)MSC

4、s的增殖和成骨分化的物理因素，如高葡萄糖，已經(jīng)很好地建立并通過幾個體外研究證明。臨床證據(jù)表明，與正常人相比，糖尿病患者的骨折不愈合和延遲愈合更高，此外糖尿病患者早期骨質(zhì)疏松的發(fā)生率高。最近的體外研究已經(jīng)證明高葡萄糖微環(huán)境降低細胞BMP的表達，細胞BMP是成骨分化的終末期期間的重要調(diào)節(jié)蛋白，因此抑制該過程。進一步了解高葡萄糖對骨代謝的負面影響并設計減輕這種合并癥的方法的研究正在進行。
　　核受體輔助抑制因子(nuclear rece

5、ptor corepressor，NCoR)屬于核受體輔助抑制因子，通過與許多其它轉(zhuǎn)錄因子（包括NF-Eb，AKT和PPARα）相互作用而發(fā)揮各種抑制功能。近年來發(fā)現(xiàn)NCoR可以與HDAC結(jié)合成復合物，通過影響蛋白的轉(zhuǎn)錄，在機體代謝、炎癥以及腫瘤發(fā)生中扮演著重要角色。JinZ報道HDAC9與視黃酸和甲狀腺激素受體(SMRT)/NCoR共抑制因子的沉默介體協(xié)同抑制PPARγ活性，并將HDAC9鑒定為骨重建和骨骼穩(wěn)態(tài)的重要和生理學相關的調(diào)節(jié)

6、劑。最近，Yi Qin證明NCoR在標準成骨培養(yǎng)基中通過P13K/AKT細胞信號通路調(diào)節(jié)大鼠間充質(zhì)干細胞的成骨分化。因此，在高葡萄糖微環(huán)境下，NCoR基因敲除對BMSCs的成骨分化的作用是什么？
　　研究目的:觀察NCoRsiRNA對BMSCs在高葡萄糖微環(huán)境下增殖和成骨分化的影響。
　　研究方法:1、根據(jù)NCoRsiRNA靶位點的選擇原則，從GenBank數(shù)據(jù)庫中擇優(yōu)選取三條siRNA序列，通過構建干擾及過表達載體，篩選出

7、最佳序列。2、檢測NCoR對BMSCs在高葡萄糖微環(huán)境下增殖的影響。在96孔板上按1×106/孔接種大鼠BMSCs，設置空白對照組、陰性對照組（無目標siRNA和NCoRsiRNA組，每組設3復孔。從轉(zhuǎn)染后第1天開始，達到65％的匯合后，將細胞樣品在含有5.5，16.5，25和35mmol/L葡萄糖濃度的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)9天后，使用甲基噻唑基四唑(MTT)測定細胞增殖，并在490nm測定吸光度。3、觀察NCoR對大鼠BMSCs誘導

8、成骨分化的影響。在含有25mmol/L（高葡萄糖）和5.5mmol/L葡萄糖（對照）的成骨培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)用NCoRsiRNA或無目標siRNA轉(zhuǎn)染的細胞21天，然后通過測量細胞ALP活性，鈣沉積RT-PCR檢測相關成骨基因;Run2，Osterix，OCN，OPN和BSP的表達，來測定成骨分化。
　　結(jié)果:1、成功構建了NCoRsiRNA及無目標siRNA質(zhì)粒載體，并篩選了最佳干擾序列，載體由廣州Cyagen生物科技公司合成。2

9、、NCoRsiRNA可使BMSCs的增殖降低。用NCoRsiRNA或無目標siRNA轉(zhuǎn)染的BMSCs在含有四個不同葡萄糖濃度（5.5，16.5，25和35mmol/L）的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)。與對照組相比，第1d三組細胞增殖差異不大。從第3d開始，在所用葡萄糖濃度，NCoRsiRNA組細胞數(shù)量及增殖明顯低于對照組。提示NCoR可促進BMSCs增殖。3、NCoRsiRNA可在高葡萄糖下促進BMSCs的成骨分化。與對照組相比，通過ALP-ELI

10、SA試劑盒和鈣診斷試劑盒測定的， NCoRsiRNA組細胞的ALP活性以及礦化（鈣沉淀）在25mmol/L（高葡萄糖）和5.5mmol/L葡萄糖下都明顯增加。此外，實時RT-PCR對成骨分化相關的五個基因Run2，Osterix，OCN，OPN和BSP的檢測顯示，與對照組相比，NCoRsiRNA組Run2，Osterix，OCN，OPN和BSP表達都顯著增加(P＜0.01)。提示NCoR負性調(diào)控大鼠BMSCs的成骨分化。
　　結(jié)論

11、:我們利用RNA干擾技術成功設計并構建了NCoR基因特異性的小干擾siRNA，以及設計并構建了無目標siRNA。經(jīng)證實，基因沉默的效果良好。我們成功將NCoR siRNA和無目標siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)，并證實轉(zhuǎn)染效率較高，然后在四個不同葡萄糖濃度下（5.5，16.5，25和35mmol/L）的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后檢測BMSCs的增殖發(fā)現(xiàn)，NCoR siRNA組BMSCs的增殖明顯下降，提示NCoR可促進BMSCs的增殖

12、。沉默NCoR時，在正常(5.5mmol/L)和高糖（25mmol/L）濃度下，大鼠BMSCs誘導成骨分化，成骨細胞分化標志基因Run2，Osterix，OCN，OPN和BSP的表達明顯增強。提示NCoR負性調(diào)控大鼠BMSCs的成骨分化。結(jié)合糖濃度分析，NCoR siRNA可中和高糖對大鼠BMSCs成骨分化的抑制作用。綜合既往研究，NCoR siRNA能改善機體胰島素敏感性，NCoR可作為潛在靶點，在糖尿病病人中改善機體胰島素敏感性，降