NCoR在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化中分子調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有多向分化的潛能，在經(jīng)典研究中，它被認(rèn)為是骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的共同起源細(xì)胞，對(duì)骨和軟骨的發(fā)生非常重要。體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在合適的環(huán)境和條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在體外進(jìn)行34-42次的分裂增殖，增殖過程中始終保持梭形并呈漩渦狀排列。不僅如此，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在冷凍保存進(jìn)行復(fù)蘇后，仍然具備干細(xì)胞的特性。BMSCs不僅存在于骨髓中，還游離于骨組織外。當(dāng)其在適當(dāng)

2、信號(hào)刺激時(shí)，可游離出骨組織，到達(dá)效應(yīng)靶器官組織中，這種生物學(xué)行為叫“歸巢”。細(xì)胞的歸巢能力與細(xì)胞周期緊密相關(guān)，且由復(fù)雜分子相互作用才能介導(dǎo)其在骨髓內(nèi)的識(shí)別與定植，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)了良好的前景。
　　脂肪組織是調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡的器官，通過調(diào)節(jié)脂肪和糖代謝動(dòng)態(tài)維持代謝與體溫的穩(wěn)定，而且能夠作為重要的屏障緩沖機(jī)械力的沖擊，保護(hù)內(nèi)臟。目前，肥胖以及由肥胖造成的代謝疾病在世界范圍內(nèi)對(duì)人類健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅，而這些疾病的

3、出現(xiàn)，與脂肪細(xì)胞的分化和功能存在密切關(guān)系。
　　BMSCs分化成脂肪細(xì)胞受細(xì)胞外信號(hào)和轉(zhuǎn)錄水平的級(jí)聯(lián)放大調(diào)控，這需要大量基因表達(dá)之間的精細(xì)時(shí)空調(diào)節(jié)。在哺乳動(dòng)物中過氧化物酶受體激動(dòng)劑(peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα，C/EBPα)是成脂分化過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。PPARγ

4、在前體脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程中被誘導(dǎo)，并且在此過程中是必需的。缺少它，前體細(xì)胞不能分化為成熟的脂肪細(xì)胞，而且PPARγ能夠促進(jìn)C/EBPα缺失的細(xì)胞進(jìn)行成脂分化。反過來，C/EBPα不能夠促進(jìn)PPARγ缺失的細(xì)胞完成脂肪分化。雖然缺少C/EBPα的細(xì)胞能夠完成脂肪分化，但是這個(gè)分化細(xì)胞是有缺陷的，它們只能聚集少量的脂肪滴，并且不能誘導(dǎo)PPARγ的表達(dá)，這指示PPARγ和C/EBPα的相互作用在整個(gè)成脂分化過程中的作用非常重要?；诔?/p>

5、脂轉(zhuǎn)錄因子的重要性，現(xiàn)有證據(jù)表明，PPARγ和C/EBPα的激活是由轉(zhuǎn)錄因子、共激活因子和共抑制因子相互作用共同來完成的，其中組蛋白乙?；负徒M蛋白去乙?；咐眠z傳學(xué)調(diào)控，發(fā)揮著巨大的作用。
　　核受體輔助抑制因子(nuclear receptor corepressor, NCoR)屬于核受體輔助抑制因子家族中的一員，其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用主要是通過募集HDAC，例如HDAC1，HDAC7，HDAC4，HDAC3及Sirt1等，并

6、且已經(jīng)清楚表明HDAC3募集形成的復(fù)合物對(duì)甲狀腺受體的轉(zhuǎn)錄抑制功能是必需的。近年來發(fā)現(xiàn)NCoR可以與HDAC結(jié)合成復(fù)合物，通過影響蛋白的轉(zhuǎn)錄，在機(jī)體代謝、炎癥以及腫瘤發(fā)生中扮演著重要角色。下調(diào)輔助抑制因子的表達(dá)會(huì)打破輔助抑制因子和輔助激活因子在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、炎癥以及其他生物進(jìn)程調(diào)節(jié)中的平衡，進(jìn)而易化腫瘤的發(fā)生。輔助調(diào)節(jié)因子也可能通過不同調(diào)節(jié)機(jī)制在不同類型癌癥或白血病中發(fā)揮著抗腫瘤的作用。另外研究發(fā)現(xiàn)，沉默（或敲除）NCo

7、R基因可以通過增加PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的脂肪分化。Pingping LI等特異性沉默小鼠脂肪細(xì)胞中NCoR基因，發(fā)現(xiàn)PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，脂肪細(xì)胞增生，局部炎癥減輕。近年來，PPARγ被發(fā)現(xiàn)扮演著成脂與成骨分化通路中的分子開關(guān)，PPARγ過表達(dá)后會(huì)抑制Runx2的表達(dá)，從而使間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。Jackson及其同事發(fā)現(xiàn)高濃度的PPARγ配體可抑制前成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞向骨細(xì)胞分化，并可通過過

8、表達(dá)PPARγ誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)NCoR可通過GPS2與活化的PPARγ結(jié)合，抑制活化的PPARγ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。NCoR協(xié)同HDAC9抑制PPARγ的活性進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞增生，在骨重塑中發(fā)揮重要作用。那么NCoR對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的脂肪分化有何影響呢？本文通過RNA干擾技術(shù)及基因過表達(dá)技術(shù)，干擾或過表達(dá)BMSC中NCoR基因的表達(dá)，觀察BMSC的脂肪細(xì)胞分化過程，檢測(cè)其中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，詳細(xì)闡述NC

9、oR對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響。
　　研究目的:構(gòu)建NCoR siRNA和pCMV-NCoR載體，為后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。將NCoR siRNA和pCMV-NCoR轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察NCoR對(duì)BMSCs的生長(zhǎng)及增殖的影響，以及和胰島素在BMSCs增殖方面的作用關(guān)系，為BMSCs生長(zhǎng)增殖的研究提供一定依據(jù)，并為BMSCs作為種子細(xì)胞的移植治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然后將NCoR siRNA和pCMV-NCoR轉(zhuǎn)染BMSCs，

10、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察NCoR對(duì)BMSCs成脂分化及增殖的影響，為今后糖脂代謝異常、肥胖等的研究和治療提供一定的實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。
　　研究方法:1、根據(jù)NCoR siRNA靶位點(diǎn)的選擇原則，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中擇優(yōu)選取三條siRNA序列，通過構(gòu)建干擾及過表達(dá)載體，篩選出最佳序列。2、檢測(cè)NCoR對(duì)BMSCs增殖的影響。在96孔板上按1×106/孔接種大鼠BMSCs，設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（無目標(biāo)siRNA）、pCMV-N1、NC

11、oR siRNA和pCMV-NCoR組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。從轉(zhuǎn)染后第1天開始，每天同一時(shí)間消化每組細(xì)胞3個(gè)孔，連續(xù)5d，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。3、觀察NCoR和胰島素在大鼠BMSCs增殖過程中的關(guān)系。設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（無目標(biāo)siRNA）、pCMV-N1、NCoR siRNA和pCMV-NCoR組，采用0mmol/L、5mmol/L、15mmol/L及45mmol/L濃度的胰島素處理各組細(xì)

12、胞3d后，細(xì)胞計(jì)數(shù)器和MTT法分別檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，評(píng)估NCoR和胰島素在大鼠BMSCs增殖過程中的作用關(guān)系。
　　研究結(jié)果:1、成功構(gòu)建了NCoR siRNA及pCMV-NCoR質(zhì)粒載體，并篩選了最佳干擾序列，載體由廣州Cyagen生物科技公司合成。2、NCoR siRNA可使BMSCs的增殖降低。與對(duì)照組相比，第1d三組細(xì)胞數(shù)量差異不大。從第3d開始，NCoRsiRNA組細(xì)胞數(shù)量及增殖明顯低于對(duì)照組，而pCMV-NCoR組

13、細(xì)胞數(shù)量及增殖明顯高于對(duì)照組。倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NCoR siRNA及pCMV-NCoR組大鼠BMSCs的形態(tài)無明顯差別，提示NCoR可促進(jìn)BMSCs增殖。3、NCoR siRNA可減弱胰島素對(duì)BMSCs增殖的促進(jìn)作用。5mmol/L濃度的胰島素促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖，但作用不明顯，15mmol/L濃度的胰島素明顯增加了BMSCs的生長(zhǎng)與增殖率，但45mmol/L濃度的胰島素不能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖。NCoR基因沉默后

14、，不同濃度胰島素對(duì)BMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖影響均減弱。而過表達(dá)NCoR后，各種濃度胰島素對(duì)BMSCs的細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖作用均得到加強(qiáng)。4、NCoR siRNA可促進(jìn)大鼠BMSCs成脂分化后細(xì)胞增殖。與對(duì)照組相比，NCoR siRNA組的增殖明顯增強(qiáng)，而NCoR過表達(dá)組的增殖則明顯降低(P＜0.05)。NCoR過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞活性顯著下調(diào)只是在特定的時(shí)間，而不呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。5、NCoR負(fù)性調(diào)控大鼠BMSCs的成脂分化。與對(duì)照組相比，NCo

15、R siRNA組細(xì)胞內(nèi)的脂肪滴明顯增加。對(duì)其增殖的檢測(cè)顯示，NCoR siRNA組的OD值顯著高于對(duì)照組。此外，Western blot和實(shí)時(shí)RT-PCR對(duì)脂肪分化相關(guān)的三個(gè)基因PPARγ、C/EBPα與LPL的檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，NCoR siRNA組C/EBPα、PPARγ包括PPARγ1與PPARγ2蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，LPL mRNA表達(dá)也顯著增加(P＜0.01)。而NCoR過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)脂滴的積累明顯減少。NCo

16、R過表達(dá)明顯抑制了細(xì)胞的增殖。pCMV-NCoR組C/EBPα、PPARγ包括PPARγ1與PPARγ2和LPL mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。
　　研究結(jié)論:我們利用RNA干擾技術(shù)成功設(shè)計(jì)并構(gòu)建了NCoR基因特異性的小干擾siRNA，以及設(shè)計(jì)并構(gòu)建了NCoR基因過表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)證實(shí)，基因沉默或過表達(dá)效果良好。我們成功將NCoR siRNA和pCMV-NCoR轉(zhuǎn)染至大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)，并證實(shí)轉(zhuǎn)染效率較高。然后檢測(cè)BMSC

17、s的增殖發(fā)現(xiàn)，NCoR siRNA組BMSCs的增殖速率明顯下降，提示NCoR可促進(jìn)BMSCs的增殖。BMSCs在不同胰島素濃度下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)15mmol/L濃度的胰島素明顯增加了BMSCs的生長(zhǎng)與增殖率，而NCoR基因沉默后，不同濃度胰島素對(duì)BMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖影響均減弱。但是過表達(dá)NCoR后，各種濃度胰島素對(duì)BMSCs的細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖作用均得到加強(qiáng)。這提示NCoR和胰島素在大鼠BMSCs的生長(zhǎng)及增殖過程中存在一定的作用關(guān)系。沉默N