Wnt通路在骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨誘導分化中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)、純化及鑒定
　　目的：建立一種體外培養(yǎng)、純化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的簡便有效方法，為后續(xù)的實驗提供細胞來源。
　　方法：
　　1.取2周純系清潔級雄性SD大鼠，全骨髓貼壁法培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，通過體外培養(yǎng)及連續(xù)傳代方法純化、擴增骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　2.倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，利用流式細胞儀（FCM）鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞表面膜抗原。
　　

2、3.對分離培養(yǎng)的細胞行成骨、成軟骨、成脂肪誘導分化，進一步確定骨髓間充質(zhì)干細胞的分化潛能。
　　結(jié)果：
　　1.取材6h后可見細胞貼壁，散在分布，3d后貼壁細胞牢固粘附，細胞體積增大，顆粒增多，呈現(xiàn)集落生長，7d后細胞胞體狹長，漩渦狀或紡錘狀排列，傳代后，細胞形態(tài)均一；
　　2.流式細胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞膜表面抗原CD90、CD105、 CD73、D34、CD45、CD14陽性率分別為99.4％、99.7%、99.

3、6%、2.0%、2.5%、3.5%；
　　3.成骨誘導分化后行茜素紅染色呈現(xiàn)大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)，成脂肪誘導分化后行油紅 O染色可見胞漿內(nèi)大量鮮紅的脂滴，折光性極強，成軟骨誘導分化后形成質(zhì)地致密的細胞團，阿利新藍染色可見細胞內(nèi)大量藍色基質(zhì)顆粒。
　　結(jié)論：全骨髓貼壁法并連續(xù)傳代法能得到純化的骨髓間充質(zhì)干細胞，是一種簡便而又有效的分選培養(yǎng)方法。用此方法培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞生長狀態(tài)良好、性狀穩(wěn)定、分化潛能強大，是一種理想的組織工

4、程種子細胞，并為后續(xù)的實驗提供了穩(wěn)定的細胞來源。
　　第二部分Wnt通路和Sox9互反饋調(diào)節(jié)在骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨分化中的作用
　　目的：通過觀察Wnt通路與Sox9在MSCs成軟骨誘導分化過程的表達及關(guān)聯(lián)，并重點研究Wnt通路調(diào)控Sox9表達調(diào)節(jié)MSCs成軟骨分化的作用及機制，以及Sox9過表達反饋調(diào)節(jié)Wnt通路的活性影響MSCs成軟骨分化的作用。從而為更精細控制MSCs分化，促進創(chuàng)傷愈合，豐富再生醫(yī)學提供理論依據(jù)。

5、r>　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，LiCl刺激干預骨髓間充質(zhì)干細胞，CCK-8法觀察骨髓間充質(zhì)干細胞增殖活性以及Western blot檢測PCNA的表達情況。
　　2.在骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨誘導分化中，Western blot、RT-qPC檢測各時期軟骨指標Sox9、Collagen2a、Aggrecan及Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin的表達情況，并LiCl及Dkk-1分別刺激干預骨髓間充質(zhì)干細胞成

6、軟骨誘導分化，重點檢測早期（第7d）及晚期（第21d）Wnt通路的蛋白表達及軟骨相關(guān)指標的mRNA及蛋白的表達情況。
　　3.在骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨誘導分化后期（21d-35d），RT-qPCR檢測成熟軟骨Collagen2a及肥大指標Collagen10、早期成骨分化指標RUNX2 mRNA水平，Western blot檢測β-catenin及Sox9蛋白的表達。通過LiCl及Dkk-1刺激干預，在骨髓間充質(zhì)干細胞成軟骨分化后

7、期（28d），Western檢測Collagen2a、Collagen10、RUNX2蛋白等分化指標以及Sox9及β-catenin蛋白水平。
　　4.Sox9慢病毒載體陽性轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞，RT-qPCR檢測成軟骨誘導分化過程中Collagen2a、Aggrecan表達水平，定量測定分泌型GAG含量，同時Western blot檢測Sox9及β-catenin蛋白水平；在成軟骨誘導分化第21天，免疫熒光檢測Collagen2

8、a表達情況，Western blot檢測Wnt通路相關(guān)蛋白GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1. LiCl刺激組的骨髓間充質(zhì)干細胞增殖能力增強，且高表達PCNA蛋白。
　　2.在成軟骨誘導分化中，Sox9、Collagen2a、Aggrecan的mRNA及蛋白表達隨著時間延長逐漸增高，分泌型GAG含量隨著時間逐漸增高，且在第14d增加顯著，而β-catenin蛋白出現(xiàn)

9、先減少后增加的表達趨勢。在成軟骨誘導分化早期（第7d），LiCl促進β-catenin蛋白表達，同時促進增殖相關(guān)蛋白PCNA及Cyclin D蛋白的表達，而Dkk-1抑制β-catenin蛋白表達并減少PCNA及Cyclin D蛋白的表達；在LiCl組Sox9、Collagen2a、Aggrecan蛋白軟骨相關(guān)指標表達，Dkk-1組有相反的結(jié)果。在成軟骨誘導分化晚期（第21d），LiCl組β-catenin蛋白表達增高而Dkk-1組表達

10、受抑制，同時LiCl組阿利新藍染色明顯增強而Dkk-1組染色減弱；分泌型的GAG含量測定有相似的結(jié)果；軟骨指標Sox9、Collagen2a、Aggrecan mRNA及蛋白測定顯示LiCl組表達明顯增高，而Dkk-1組明顯減低。3.在成軟骨誘導分化后期（21d-35d），隨著時間的延長，Collagen2a表達逐漸減少，Collagen10及RUNX2 mRNA表達逐漸增高，而β-catenin蛋白表達逐漸增多，與Sox9蛋白表達恰恰

11、相反。在LiCl及Dkk-1干預下，我們發(fā)現(xiàn)LiCl在促進β-catenin蛋白表達增多的同時，明顯促使Sox9及Collagen2a蛋白表達下調(diào)，并上調(diào)Collagen10a及RUNX2蛋白的表達。
　　4.在對骨髓間充質(zhì)干細胞成功轉(zhuǎn)染Sox9慢病毒后，我們設(shè)置了Sox9慢病毒轉(zhuǎn)染組。在成軟骨誘導分化中，轉(zhuǎn)染組明顯高表達Collagen2a及Aggrecan mRNA，分泌型GAG含量測定也顯示轉(zhuǎn)染組顯著高于對照組，同時在Wes

12、tern blot檢測中，轉(zhuǎn)染組β-catenin蛋白表達顯著低于對照組。在成軟骨誘導分化第21天，免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染組明顯高表達Collagen2a，此時的Western blot檢測顯示GSK-3β蛋白及β-catenin磷酸化水平增高。
　　結(jié)論：
　　1.LiCl能激活Wnt通路促進骨髓間充質(zhì)干細胞快速增殖。
　　2.LiCl激活Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin，在成軟骨誘導分化中，早期主要促進骨髓間充質(zhì)干細