lncRNA對SPA作用下人骨髓間充質干細胞成骨分化能力的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　采用不同濃度的SPA處理hBMSCs，通過檢測炎癥因子的表達以及成骨活性變化情況，構建模擬骨髓炎細胞模型;然后，通過基因芯片分析SPA處理hBMSCs成骨分化的過程中l(wèi)ncRNA差異的變化，根據生物信息學分析的結果，確定lncRNA的靶基因;進一步分析lncRNA通過調控其靶基因在SPA處理的hBMSCs成骨誘導中的作用，明確lncRNA在骨髓炎狀態(tài)下調控hBMSCs成骨分化的機制。本研究是首次從lncRNA水平去闡述

2、骨髓炎情況下hBMSCs成骨能力不足的原因，為骨髓炎并缺損的研究提供新的理論基礎及研究方向，為下一步的研究提供堅實的基礎。
　　方法:
　　1.SPA作用下體外骨髓炎模型的構建
　　為了模擬骨髓炎細胞模型，不同濃度的SPA處理hBMSCs細胞。處理72h后，24孔培養(yǎng)板細胞上清被收集進行ELISA檢測IL-1a、IL-6和TNF-a。添加不同濃度的SPA的成骨分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，然后收集細胞進行茜素紅染色檢測鈣結節(jié)沉積

3、和堿性磷酸酶檢測;
　　2.分析及驗證SPA處理下hBMSCs成骨分化過程中l(wèi)ncRNA的變化
　　hBMSCs在含有或者不含有1μg/ml SPA的成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，收集細胞進行l(wèi)ncRNA基因芯片分析。然后分析即表達差異顯著又和成骨分化密切相關的lncRNA，將以上差異基因進行qRT-PCR驗證，篩選出目的基因。
　　3.差異lncRNA對SPA骨髓炎模型下BMMSC成骨分化功能的影響
　　合成3條

4、NONHSAT009968干擾序列。培養(yǎng)hBMSCs細胞，根據操作說明書，使用Lipo fectamine2000試劑將大約200nm siRNA轉染到hBMSCs。干擾效率采用qRT-PCR檢測。采用siRNA-2序列進行慢病毒包裝。根據標準操作進行慢病毒生產、濃度和滴定測定、感染條件確認以及穩(wěn)定細胞株篩選。慢病毒表達NONHSAT009968-shRNA或空的慢病毒，感染后3天，收集骨髓間充質干細胞檢測NONHSAT009968確認

5、是否成功沉默。慢病毒表達NONHSAT009968-shRNA或空的慢病毒感染的hBMSCs細胞培養(yǎng)14天和21天。采用茜素紅染色檢測鈣結節(jié)沉積。收集細胞進行western blot檢測Runx2、OCN、OPN和COL1A1的表達，ELISA檢測IL-1a、IL-6、TNF-a和堿性磷酸酶檢測。分析干擾NONHSAT009968對SPA處理下的hBMSCs的成骨分化能力的影響。
　　4.差異lncRNA對SPA骨髓炎模型下BMM

6、SC成骨分化功能影響的作用機制
　　慢病毒表達NONHSAT009968-shRNA或空的慢病毒感染的hBMSCs細胞培養(yǎng)14天和21天。收集細胞采用qRT-PCR和western blot檢測Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達，分析干擾NONHSAT009968對Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達的影響。
　　結果:
　　1.SPA骨髓炎模型構建成功
　　SPA可以顯著增加hBM

7、SCs細胞成骨分化過程中炎癥因子IL-1a、IL-6和TNF-a的分泌(P＜0.05)，而且炎癥因子的分泌對SPA呈濃度依賴性。另外，茜素紅染色顯示不同濃度的SPA能夠明顯抑制鈣結節(jié)沉積，而且抑制程度和SPA的濃度有密切聯(lián)系。然后ALP檢測結果表明SPA處理能夠抑制ALP的活性(P＜0.05)，并且抑制能力呈濃度依賴性。以上結果表明在1μg/ml SPA能夠明顯增加炎癥因子IL-1a、IL-6和TNF-a的分泌，抑制鈣結節(jié)沉積和ALP的

8、表達。說明SPA可以促進炎癥因子的表達及抑制hBMSCs成骨能力的下降，這一結果與體內骨髓炎狀態(tài)表現(xiàn)一致。因此，在體外采用1μg/ml SPA處理hBMSCs能夠模擬體內骨髓炎狀態(tài)，體外可構建SPA骨髓炎模型。
　　2.lncRNA基因芯片結果分析
　　(1) SPA處理的骨髓間充質干細胞和對照組相比，存在2033個異常表達的lncRNAs。其中641個lncRNAs下調，1392個lncRNAs上調（倍數變化＞2.0，P＜

9、0.05）。從mRNA表達分析數據中發(fā)現(xiàn)SPA處理的骨髓間充質干細胞和對照組相比，存在449個異常表達的mRNA，其中318個mRNA顯著下調，131個mRNA顯著上調（倍數變化＞2.0，P＜0.05）。
　　(2)基于KEGG途徑分析，表達上調的mRNA包含20個不同的信號通路，最豐富的通路是唾液分泌，谷氨酸能突觸，嗅覺傳導和胰島素分泌。基于KEGG途徑分析，表達下調的mRNA包含20個不同的信號通路，最豐富的通路是造血，視黃醇

10、的新陳代謝，藥物代謝，細胞粘附分子和細胞色素代謝外源性物質。為了理解差異表達基因的功能，所有的差異表達基因映射到GO數據庫中并比較其背景?；趯ι镞^程進行GO分析，上調的轉錄本主要富集在纖溶酶原激活和水轉運，而下調的轉錄本主要富集在對糖皮質激素刺激的細胞反應和細胞糖脂化?；趯Ψ肿庸δ苓M行GO分析，上調的轉錄本主要富集在神經遞質轉運體活動和鈣調素結合，而下調的轉錄本主要富集在對配體-依賴的核受體轉錄共激活和葡萄糖醛酸基轉移酶活性。

11、r>　　(3)通過cis-100k分析，五個潛在的和成骨分化相關且表達差異顯著的lncRNA被鑒定出來，包括NONHSAT125464、ENST00000504555、NONHSAT098635、NONHSAT054627和NONHSAT009968。lncRNA的潛在靶向調控目標分別包括骨形態(tài)形成蛋白1、SMAD1、SMAD1、膠原蛋白I型α1和Wnt3a，這些蛋白和成骨細胞分化密切相關。然后將差異的lncRNA采用qRT-PCR驗證

12、，qRT-PCR結果表明SPA處理中和對照組中NONH SAT125464、ENST00000504555、NONHSAT098635、NONHSAT054627和NONHSAT009968的表達顯著上升（P＜0.05），和基因芯片的結果一致。其中NONHSAT009968的表達結果提高的最為明顯，后續(xù)實驗采用NONHSAT009968以及其靶基因Wnt3a進行研究。
　　3.沉默NONHSAT009968能夠逆轉SPA對hBMS

13、Cs細胞成骨分化的影響
　　在siRNA的檢測中siRNA-2和siRNA-3轉染后能夠顯著降低NONHSAT009968的表達(P＜0.05)，其中siRNA-2轉染后NONHSAT009968的表達量最低，干擾效率最好，可以用于后續(xù)NONHSAT009968的干擾序列。當感染NONHSAT009968-shRNA后采用qRT-PCR檢測NONHSAT009968的表達，結果表明NONHSAT009968-shRNA干擾能夠顯著

14、降低NONHSAT009968的表達(P＜0.05)。NONHSAT009968-shRNA和NC在1μg/ml SPA中培養(yǎng)14天和21天。茜素紅染色結果表明:無論在培養(yǎng)后14天還是21天，NONHSAT009968沉默組和NC組相比，都能夠增加鈣結節(jié)沉積(P＜0.05)。堿性磷酸酶活性檢測結果表明無論在培養(yǎng)后14天還是21天，NONHSAT009968沉默和NC組相比，都能夠增加堿性磷酸酶活性（P＜0.05）。另外，沉默NONHSA

15、T009968能夠增加成骨分化相關的Runx2、OCN、OPN和COL1A1蛋白的表達（P＜0.05）。這些結果表明沉默NONHSAT009968能逆轉SPA抑制的hBMSCs成骨分化。
　　4.沉默NONHSAT009968促進Wnt3a以及β-catenin和GSK-3β的表達
　　SPA處理能夠顯著抑制Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達(P＜0.05)，且該抑制結果還呈時間依賴性。該結果還表明干擾NON

16、HSAT009968的表達能夠增強Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達（P＜0.05）。該結果表明干擾NONHSAT009968促進成骨分化的機制可能和Wnt3a以及β-catenin和GSK-3β的表達相關。
　　結論:
　　(1)本研究1μg/ml的SPA處理能夠促進IL-1a、IL-6和TNF-a的表達，降低堿性磷酸酶的表達和鈣結節(jié)沉積，抑制Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達，抑制hBMS

17、Cs的成骨分化，成功模擬骨髓炎狀態(tài)。
　　(2)在SPA處理hBMSCs的成骨分化的過程中，通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)存在5個和成骨分化相關的lncRNA，有NONH SAT125464、ENST00000504555、NONHSAT098635、 NONHSAT054627和 NONHSAT009968。其中 lncRNANONHSAT009968的表達上升最為明顯，而且lncRNA NONHSAT009968潛在的cis-regul

18、ated mRNA目標為Wnt3a。
　　(3)進一步研究發(fā)現(xiàn)通過干擾lncRNA NONHSAT009968的表達能夠顯著提高Wnt3a、β-catenin和GSK-3β的表達，促進鈣結節(jié)沉積，提高ALP的表達，促進成骨相關蛋白Runx2、OCN、OPN和COL1A1的表達，改善SPA抑制的hBMSCs的成骨分化。
　　(4)本研究首次從lncRNA角度闡明骨髓炎狀態(tài)下成骨能力下降的原因及其作用機制，為骨髓炎狀態(tài)下成骨能力