佛手柑內酯對骨髓間充質干細胞成骨分化能力影響的初步研究.pdf

1、目的：
　　1.探索不同濃度BP對BMMSCS增殖活性的影響，篩選適合BMMSCS分化增殖的藥物濃度。
　　2.研究體外條件下不同濃度BP對BMMSCS分化增殖能力的影響，分析BP促進BMMSCS向成骨細胞分化的分子機制。
　　3.在骨質疏松的動物模型上通過對骨質疏松癥的治療，驗證BP在活體內促進BMMSCS轉化為成骨細的有效機制
　　方法：
　　1、BMMSCS分離培養(yǎng)及BP濃度對其增殖的影響
　　

2、選取4周大的雌性C57BL/6小鼠4只，斷頸法處死后消毒雙下肢手術部位，用無菌眼科剪依次剪開皮膚、肌肉，無菌取出雙側脛骨和股骨，并放入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中清洗。剪掉脛骨和股骨的兩端，暴露骨髓腔，用注射器反復吸取培養(yǎng)基沖洗脛骨和股骨中的骨髓，反復吹打均勻分散后用離心管800r/min離心4min，細胞沉淀加入10％胎牛血清和1％雙抗（青、鏈霉素）的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，接種在25cm2培養(yǎng)瓶中，密度為1×106/ml，放入培

3、養(yǎng)箱中孵育。48小時后除去未貼壁的細胞，更換新的培養(yǎng)液。每三天換一次培養(yǎng)液，待細胞融合至90％以上時進行消化傳代。選取第四代BMMSCS，種入96孔板，往完全培養(yǎng)基中加入BP（溶解于DMSO），設置不同濃度組(濃度為分別為0.1μM/L，1μM/L，10μM/L，100μM/L)，對照組加入相同體積的二甲基亞砜(DMSO)每組設10個孔，培養(yǎng)14天后，每孔加入10μ LCCK8試劑，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，酶標儀450nm波長

4、讀板，獲取吸光度值（OD值），了解不同濃度BP對BMMSCS增殖的影響。
　　2、BP對BMMSCS體外誘導分化成成骨細胞的影響
　　取第4代BMMSCS種入六孔板內，每孔細胞數(shù)為1×105，加入2ml成骨誘導培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基加β-磷酸甘油10mMol/L，抗壞血酸50μMol/L，地塞米松0.1μMol/L），隔三天換一次液。每組加入的培養(yǎng)基和其體積均是一樣的。實驗組加入不同濃度BP，即0.1，1，10μM/L，對照組加

5、入相同體積DMSO，每組11個孔。在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)14天后，用試劑盒測量裂解細胞的吸光度從而測量細胞內的堿性磷酸酶(ALP)活性。部分細胞用4％多聚甲醛固定后，用BCIP/NBT ALP顯色劑染色。用免疫蛋白印跡技術(WB)檢測RUNX2和OCN在細胞內的表達，用多種方式多個指標觀察BP對BMMSCS成骨分化的影響，在機制方面，本研究選擇了β-catenin和GSK-3β的蛋白免疫印跡來驗證BMMSCS中Wnt通路的狀況，從信號通路上揭

6、示BP促進BMMSCS成骨的機制。
　　3、BP在體內促進成骨的研究
　　36只雌性C57BL/6小鼠平均分為三組，每組12只:實驗組（OVX+BP組，手術切除雙側卵巢加用BP）、對照組（OVX組，僅雙側切除卵巢）、陰性對照組（Sham組，僅做模擬手術，不切除卵巢）。實驗組小鼠每天以20mg/kg/d進行灌胃飼養(yǎng)，對照組和陰性對照組用同樣體積的生理鹽水進行灌胃。兩個月后，從三組小鼠中各取3只的股骨標本做顯微CT(Micro-

7、CT，μCT)掃描和三維重建，掃描部位為股骨上段。顯微CT掃描設置的參數(shù)為:掃描電壓70 KV，功率為30 W，掃描電流為429μA，每次掃描厚度為20μm。另從各組取3只小鼠股骨標本，并且對股骨上段進行HE染色小鼠股骨上段骨顯微結構的影響，觀察骨小梁的數(shù)目，骨皮質厚度等。取各組剩余6只小鼠的股骨標本，并且對股骨上段進行OCN和RUNX2的免疫組織化學染色（3只進行OCN免疫組織化學染色，3只進行RUNX2的免疫組織化學染色）。

8、　　4、統(tǒng)計學方法
　　實驗數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料結果以均數(shù)±標準差表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD檢驗，檢驗水平α=0.05，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、BP濃度對BMMSCS增殖能力的影響
　　在將BP作用于BMMSCS觀察對成骨能力的影響前，我們需要一個合適的濃度，對細胞沒有毒性作用。運用CCK8法檢測各濃度BP處理

9、的BMMSCS的吸光度值。結果顯示:0，0.1，1，10μM/L四組的吸光度值沒有統(tǒng)計學差異，表明這三個濃度的BP對細胞活性沒有影響，而100μM/L的吸光度值明顯降低，說明了該濃度BP明顯抑制了細胞增殖。
　　2、BP在體外對BMMSCS成骨分化的影響。
　　本研究通過ALP活性檢測及染色發(fā)現(xiàn)，在成骨誘導培養(yǎng)基中加入BP后促進了BMMSCS中ALP的活性，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，并且隨著濃度的增高

10、，ALP的表達也會隨之升高，各濃度組之間同樣具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。從OCN和RUNX2的蛋白免疫印跡和利用OSX(Osterix，成骨相關轉錄因子)的免疫熒光染色觀察可以看出，BP在成骨誘導培養(yǎng)基中同樣可以足進BMMSCS中OCN、RUNX2和OSX的表達，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，隨著濃度的升高，表達量也會增加，各濃度組差異同樣具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。通過對機制的研究，在BMMSCS中，加入BP

11、的實驗組β-catenin和GSK-3β的表達同樣增強，且隨著濃度升高表達增強(P＜0.05)。
　　3、BP在骨質疏松模型內促進成骨的研究結果
　　首先，我們在小鼠H&E染色中發(fā)現(xiàn)，和陰性對照組相比，位于對照組與實驗組小鼠的股骨上段的骨小梁排列稀疏，骨小梁和骨皮質的厚度變薄，但是實驗組的骨小梁和骨皮質情況較對照組組明顯好轉。另外，通過對小鼠的股骨進行Micro-CT掃描及RUNX2免疫組織化學染色和OCN的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)

12、，可以發(fā)現(xiàn)相似的結果，即手術后的小鼠可以發(fā)現(xiàn)明顯的骨質疏松情況，陰性對照組的骨小梁數(shù)目、OCN和RUNX2的表達較實驗組和對照組的均要高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)而骨小梁分離度較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但是BP處理之后的小鼠骨質疏松情況較對照組的骨小梁數(shù)量增多，OCN和RUNX2表達增高，骨小梁分離度降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.100μM/L的BP對BMMSCS的