miRNAs對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、研究背景：
　　miRNA(microRNA)是一類短小的非編碼單鏈小分子RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)對(duì)基因表達(dá)發(fā)揮著重要調(diào)控作用。多項(xiàng)研究表明，miRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、分泌、遷移、惡性轉(zhuǎn)化等細(xì)胞功能方面存在重要調(diào)控功能，在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、組織器官分化、疾病的發(fā)生發(fā)展等復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程中亦扮演著重要角色。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，可以分化為多種中胚層細(xì)胞及數(shù)種非中胚層細(xì)胞。已經(jīng)

2、有很多研究證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化異常在諸如股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松等疾病當(dāng)中扮演著重要角色。miRNA通過(guò)對(duì)大量基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化方向產(chǎn)生重要的調(diào)控作用。本研究擬在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上對(duì)此前篩選出的miRNAs進(jìn)行功能驗(yàn)證，明確其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化方向的影響。
　　研究目的：
　　1.復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代BMSC，用生物信息學(xué)方法對(duì)此前研究所得miRNA進(jìn)行篩選;
　　2.定制agomir及

3、antagomir，通過(guò)轉(zhuǎn)染改變骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)miRNA的水平，通過(guò)染色研究轉(zhuǎn)染后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化方向，從而篩選出對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化方向存在影響的miRNA;
　　3.采用全基因組芯片檢測(cè)受到miRNA調(diào)控的靶基因及其表達(dá)水平。
　　研究方法：
　　采用Scien Cell公司的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代后取得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞第三-第八代，采用agomir和antagomir對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

4、進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染后96小時(shí)進(jìn)行油紅0染色、茜素紅染色、Ⅱ型膠原染色，觀察向成骨、成脂、成軟骨方向的分化能力;將轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取RNA后送檢基因芯片，篩選差異表達(dá)的基因。
　　研究結(jié)果：
　　1.復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代后得到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞P3-P8代;結(jié)合生物信息學(xué)，根據(jù)此前試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步篩選出對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化可能存在影響的8種miRNA;
　　2.結(jié)合agomir、antagomir轉(zhuǎn)染及油紅0、茜素紅

5、、Ⅱ型膠原染色結(jié)果，Hsa-miR-1303具備調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的能力;
　　3.采用全基因組芯片檢測(cè)miRNA轉(zhuǎn)染前后的基因表達(dá)變化，從而得出hsa-mir-1303調(diào)控的靶基因:ANKH;
　　結(jié)論：
　　1.應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選出的8種miRNA當(dāng)中，has-mir-1303可以調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化。
　　2.應(yīng)用全基因組芯片驗(yàn)證出has-mir-1303的靶基因:ANKH;經(jīng)功能富集分析得出