低強度脈沖超聲對骨髓間充質干細胞多向分化的影響.pdf

1、目的：
　　近年來，因建筑交通行業(yè)的迅猛發(fā)展和人口老齡化的加劇所導致的骨折嚴重危害著我們的健康，促進骨折的愈合、注意避免發(fā)生骨折延遲愈合或不愈合仍是我們醫(yī)學界面臨的一個挑戰(zhàn)。低強度脈沖超聲（Low intensity pulsed ultrasound, LIPUS）以費用低廉、無感染、無創(chuàng)傷、治療簡單、無不良反應、效果理想受到人們的關注，然而，LIPUS促進骨愈合的作用機制目前仍不明確。我們分析LIPUS促進骨愈合的關鍵是 LI

2、PUS通過加速 BMSCs多向分化來實現(xiàn)修復受損骨組織。因此，本課題我們將研究LIPUS對BMSCs多向分化的影響，計算LIPUS可以提高BMSCs分化的分化率。并將在動物實驗中，初步觀察LIPUS聯(lián)合BMSCs治療骨缺損的可行性。
　　方法：
　　1. BMSCS細胞分八個實驗組：對照組、成骨誘導組、血管內皮誘導組、雙誘導組、超聲組、成骨誘導+超聲組、血管內皮誘導+超聲組、雙誘導+超聲組。超聲組、成骨誘導+超聲組、血管內皮

3、誘導+超聲組、雙誘導+超聲組細胞使用低強度脈沖超聲儀(LIPUS頻率0.6MHz,重復頻率1kHz,占空比20％)以0.03W/cm2的強度每天輻照20min，連續(xù)輻照13d；其余四組使用同樣方法進行超聲假照。所有實驗組細胞均于0d、1d、3d、7d、9d、11d、13d進行MTT檢測細胞增殖活性，于5d、9d、13d取樣本進行以下檢測：倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、、透射電鏡觀察細胞超微結構變化、激光共聚焦檢測細胞成骨和血管內皮分化情況、流

4、式細胞表面抗原檢測細胞分化率，熒光PCR檢測骨鈣素和vWF基因的表達。
　　2.將24只雌性SD大鼠隨機分為四組：對照組，LIPUS組，BMSCS組和BMSCS+LIPUS組。用直徑1.6mm的骨穿針建立統(tǒng)一的大鼠骨缺損“孔”狀模型。造模當天各組開始分別進行治療，連續(xù)觀察4周，并于治療2周、4周后對各組大鼠進行X線成像、股骨樣本采圖和HE染色等檢測。
　　結果：
　　1.細胞形態(tài)觀察、電鏡檢測和共聚焦檢測顯示 LIPU

5、S輻照后的各組細胞，開始分化的時間要早于對應假照組，細胞向特定誘導方向分化的數(shù)量也多于對應假照組。流式表面抗原檢測顯示超聲組細胞分化率達到（11±0.11），對照組分化率為（5.95±0.05），兩組間差異具有顯著性（P＜0.05）；成骨+超聲組細胞分化率達到（17.58±0.046），成骨組分化率為（10.39±0.08），兩組間差異具有顯著性（P＜0.05）；血管內皮+超聲組細胞分化率達到（99.46±0.05），血管內皮組分化率為

6、（96.97±0.03），兩組間差異具有顯著性（P＜0.05）；雙誘導+超聲組細胞分化率達到（34.79±1.21），雙誘導組分化率為（24.77±0.3），兩組間差異具有顯著性（P＜0.05）。熒光PCR結果顯示，不論骨鈣素基因還是vWF基因，所有超聲組的表達均明顯高于其對應的假照組，除了第5天成骨與成骨+超聲組vWF基因表達、血管內皮組與血管內皮+超聲組OC基因表達沒有差異性（P>0.05）外，其余各組均是LIPUS作用后細胞OC基

7、因和vWF基因的表達高于其對應的未進行LIPUS輻照的實驗組的基因，且差異具有顯著性（P＜0.05）。
　　2. LIPUS與BMSCs聯(lián)合治療大鼠骨缺損，結果顯示，LIPUS組與BMSCS組治療骨愈合均效果，兩組之間愈合情況差異不大，測試兩組未愈合骨組織表面積顯示兩組間無顯著性差異（P＞0.05），但HE染色檢測中可以發(fā)現(xiàn)兩組的新生骨骨質不如周邊正常骨。聯(lián)合治療組骨愈合情況明顯優(yōu)于LIPUS組和BMSCS組，4周時缺損處骨組織基

8、本修復，統(tǒng)計未愈合組織面積后與LIPUS組和BMSCS相比具有極顯著性差異（P＜0.01）。且根據HE染色結果來看，該組新生薄片骨骨組織排列整齊統(tǒng)一，還有新生血管生成。
　　結論：
　　1. LIPUS可以加速BMSCs向成骨和血管內皮方向分化，使其更快生成骨組織和血管組織。在雙向同時誘導BMSCs時，可以看到BMSCs同時分化出血管和骨組織，這為以后生成血管化骨組織提供研究基礎。在雙向同時誘導條件下，LIPUS對BMSCs