褪黑素對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響.pdf

1、研究背景: 目前全世界約2億人患有骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)，其發(fā)病率已躍居常見(jiàn)病、多發(fā)病的第七位，特別需要強(qiáng)調(diào)的是，目前醫(yī)學(xué)上還未有安全而有效的根治方法。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓內(nèi)脂肪組織增多與骨質(zhì)疏松存在密切聯(lián)系。一旦骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)過(guò)多地向成脂細(xì)胞方向分化，相應(yīng)地，向成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞數(shù)就會(huì)減少，進(jìn)而引起成骨缺陷的骨質(zhì)疏松。褪黑素

2、(melatonin，MT)是松果體(pineal gland,PG)和骨髓在生理?xiàng)l件下，合成和分泌的一種激素，MT直接或間接參與了體內(nèi)所有的體液調(diào)節(jié)，隨著人的衰老，MT的分泌量隨之降低。根據(jù)最新的研究顯示：MT可以促進(jìn)骨折愈合和抑制脂肪酸聚集作用。這些新發(fā)現(xiàn)的MT的作用，再加上MT分泌的年齡依賴性，讓我們對(duì)OP的研究有了新的思路和方向。 目的: 通過(guò)體外分離和培養(yǎng)大鼠BMSCs，研究MT對(duì)大鼠BMSCs成脂分化的影響以及MT作

3、用的機(jī)制，進(jìn)一步探討OP的發(fā)病機(jī)制。 方法: 1.大鼠BMSCs原代培養(yǎng)與鑒定6月齡SD大鼠，無(wú)菌條件下取出骨髓，采用Percoll淋巴細(xì)胞分離液梯度離心法進(jìn)行分離，獲得原代hMSCs后，接種于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90％融合時(shí)，用0.25g/L濃度胰蛋白酶消化傳代。在倒置顯微鏡下觀察BMSCs的形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代大鼠BMSCs CD29、CD34及CD44的表達(dá)。 2.大鼠

4、BMSCs脂化誘導(dǎo)培養(yǎng)及分組干預(yù)取大鼠骨髓分離培養(yǎng)MSCs,經(jīng)傳代脂向分化，分組進(jìn)行干預(yù)。對(duì)照組為單純脂向分化(模型)組：實(shí)驗(yàn)A組用MT進(jìn)行干預(yù)；實(shí)驗(yàn)B組用MT和其受體拮抗劑2-苯基-N-乙酰色胺(luzindole,LZD)共同干預(yù)。檢測(cè)脂肪細(xì)胞的比例來(lái)比較各組的脂化程度，并應(yīng)用Rt-PCR技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中成脂轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體γ(PPAR γ)mRNA的表達(dá)。 結(jié)果: 1.密度梯度離心法和貼壁分離培

5、養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)獲得了BMSCs細(xì)胞。 2.加入MT干預(yù)的實(shí)驗(yàn)A組，與單純脂化誘導(dǎo)的對(duì)照組比較，可使BMSCs脂化明顯受抑(p<0.01)。加入LZD和MT干預(yù)的實(shí)驗(yàn)B組，與單純脂化誘導(dǎo)的對(duì)照組比較，兩組細(xì)胞的脂化程度無(wú)明顯差別(p>0.05)；而與只加入MT干預(yù)的實(shí)驗(yàn)A組比較，實(shí)驗(yàn)B組的脂化程度明顯提高(p<0.01)。 結(jié)論: 1.采用密度梯度離心法和貼壁分離培養(yǎng)，能在體外獲得BMSCs細(xì)胞。進(jìn)一步驗(yàn)證骨