高表達(dá)CGRP對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響.pdf

1、背景和目的:
　　牙周病是口腔的常見(jiàn)疾病之一，是由牙菌斑引起的慢性炎癥，導(dǎo)致牙周組織的破壞甚至牙槽骨的嚴(yán)重吸收。隨著組織再生工程領(lǐng)域的深入研究，牙周組織再生技術(shù)得以提高，其中相關(guān)細(xì)胞因子及干細(xì)胞技術(shù)的研究已取得顯著成就，因牙周炎病因比較復(fù)雜，修復(fù)機(jī)制尚未明確，再生的牙周組織與健康生理性牙周組織相比不論從生理形態(tài)還是功能上都有較大的差距，臨床中很難實(shí)現(xiàn)健康生理性牙周組織的再生。
　　降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin ge

2、ne-related peptide，CGRP)是一種神經(jīng)多肽物質(zhì)，由37個(gè)氨基酸組成，因其有較多的重要調(diào)節(jié)作用且分布廣泛而在實(shí)驗(yàn)中作為人們研究的主要神經(jīng)肽物質(zhì)。大量研究證實(shí)CGRP可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)骨組織生長(zhǎng)代謝，實(shí)現(xiàn)骨組織再生的功能。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):在離斷下牙槽神經(jīng)的大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)中后期再生的骨質(zhì)較正常骨質(zhì)疏松，骨小梁也表現(xiàn)的較稀疏。CGRP作為神經(jīng)肽的主要物質(zhì)之一可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)骨組織生長(zhǎng)代謝，實(shí)現(xiàn)骨組織再生的功能。<

3、br>　　針對(duì)以上臨床難題和理論基礎(chǔ)我們做了牙周組織再生的相關(guān)研究，借助于CGRP可促進(jìn)牙槽骨代謝，重點(diǎn)解決再生的牙周組織在生理形態(tài)及功能上最大程度接近于健康的牙周組織，為臨床中解決牙周炎引起的牙槽骨破壞實(shí)現(xiàn)生理性再生提供重要的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.rBMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定
　　分離獲取Wistar大鼠股骨處全骨髓并培養(yǎng)傳代，獲得穩(wěn)定的第三代rBMSCs。Flow cytometer檢測(cè)表面標(biāo)志抗原，Oi

4、l red O、Alizarin Red染色檢測(cè)rBMSCs的成脂及成骨分化能力。
　　2.rBMSCs高表達(dá)CGRP基因的構(gòu)建
　　將重組慢病毒載體pLenO-DCE-CGRP與輔助包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，48h、72h后收集上清液，高速離心過(guò)濾后得到高滴度病毒液，置于-80℃?zhèn)溆谩Ｂ《靖腥緍BMSCs后檢測(cè)CGRP mRNA和蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)分為三組:CGRP組、Vector組、對(duì)照組。
　　3.高表達(dá)

5、CGRP對(duì)rBMSCs增殖和成骨分化的影響
　　1) CCK-8、Flow cytometer檢測(cè)高表達(dá)CGRP對(duì)rBMSCs增殖能力的影響;
　　2) Realtime PCR、Western Blot檢測(cè)ALP（alkaline phosphatase，堿性磷酸酶）、BSP（bonesialoprotein，骨涎蛋白）、OPN（Osteopontin，骨橋蛋白）、Runx2（核心結(jié)合因子-2）mRNA和蛋白的表達(dá)水平;<

6、br>　　3)通過(guò)Alizarin Red染色測(cè)定三組rBMSCs的成骨分化能力。
　　4)高表達(dá)CGRP促進(jìn)rBMSCs成骨分化的機(jī)制研究
　　Western Blot檢測(cè)三組細(xì)胞OPG、RANKL的蛋白表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)分析OPG/RANKL。
　　結(jié)果:
　　1.rBMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定
　　分離獲取Wistar大鼠股骨處全骨髓并培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)良好，大部分呈梭形，放射狀排列。Flow cytometer

7、檢測(cè)第三代rBMSCs的表面標(biāo)志抗原-CD34、CD45、CD44、CD90，表達(dá)率依次為0.3％、2.8％、92.3％、97.6％，符合rBMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)的特性。Oil red O、Alizarin Red染色檢測(cè)成脂及成骨誘導(dǎo)后的rBMSCs，染色結(jié)果顯示都為陽(yáng)性。
　　2.rBMSCs高表達(dá)CGRP基因的構(gòu)建
　　病毒液感染rBMSCs后，相對(duì)于Vector組和對(duì)照組，CGRP組的CGRP蛋白及mRNA的表達(dá)量

8、明顯升高(P＜0.05)，而Vector組和對(duì)照組表達(dá)較弱且無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　3.高表達(dá)CGRP對(duì)rBMSCs增殖和成骨分化的影響
　　CCK-8、Flow cytometer檢測(cè)結(jié)果均顯示CGRP組的rBMSCs增殖能力高于Vector組和對(duì)照組(P＜0.05);檢測(cè)三組細(xì)胞礦化誘導(dǎo)1w、2w后ALP、BSP、OPN、Runx2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，檢測(cè)結(jié)果顯示:CGRP組較Vector組和對(duì)照組AL

9、P、BSP、OPN和Runx2 mRNA和蛋白在1w、2w時(shí)的表達(dá)量明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，Vector組和對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05);rBMSCs成骨誘導(dǎo)4w后Alizarin Red染色CGRP組的礦化結(jié)節(jié)較其余兩組多(P＜0.05)，其余兩組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。高表達(dá)CGRP促進(jìn)rBMSCs成骨分化的機(jī)制研究:礦化誘導(dǎo)1w后三組rBMSCs OPG蛋白的表達(dá)量CGRP組高于Vector組和對(duì)照組;而RANKL蛋白的