高糖高脂環(huán)境對(duì)骨髓和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化功能的影響.pdf

1、目的:
　　模擬糖尿病患者的內(nèi)環(huán)境，觀察高糖高脂對(duì)人來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)(BMSCs)和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSCs)增殖活性和成骨能力的影響，以期為組織工程方法促進(jìn)糖尿病患者骨折愈合所需種子細(xì)胞的選擇提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原CD29、CD90和CD34、CD45的表達(dá)。高糖高脂環(huán)境對(duì)BMSCs和HUM

2、SCs增殖能力的影響采用CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)法。實(shí)驗(yàn)共分4組，收集第5代的BMSCs和HUMSCs分別接種于4塊96孔板，A組:接種BMSCs，低糖細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。B組:接種BMSCs，高糖高脂完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。C組:接種HUMSCs，低糖細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。D組:接種HUMSCs，高糖高脂完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組設(shè)35個(gè)復(fù)孔，每天隨機(jī)抽取5個(gè)復(fù)孔，連續(xù)測(cè)試7天。高糖高脂對(duì)BMSCs和HUMSCs的成骨分化能力的影響。實(shí)驗(yàn)共分4組。A組

3、:BMSCs空白對(duì)照組采用傳統(tǒng)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。B組:高糖高脂成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基作為BMSCs實(shí)驗(yàn)組。C組:HUMSCs空白對(duì)照組采用傳統(tǒng)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。D組:HUMSCs實(shí)驗(yàn)組采用高糖高脂成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。(1)觀察4組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)前和成骨誘導(dǎo)3天，14天時(shí)的形態(tài)。(2)成骨誘導(dǎo)7天，應(yīng)用堿性磷酸酶染色試劑盒對(duì)4組細(xì)胞進(jìn)行染色。(3)成骨誘導(dǎo)21天，應(yīng)用茜素紅對(duì)4組細(xì)胞進(jìn)行染色。(4)成骨誘導(dǎo)15天，應(yīng)用DBA染色試劑盒對(duì)4組細(xì)胞進(jìn)行Ⅰ型

4、膠原蛋白染色。(5)應(yīng)用細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性比色法定量檢測(cè)試劑盒，于成骨誘導(dǎo)第7、10、15天對(duì)4組細(xì)胞進(jìn)行ALP的定量檢測(cè)。(6)成骨誘導(dǎo)21天，應(yīng)用RT-RPC法對(duì)比各組骨鈣素基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　一:BMSCs和HUMSCs細(xì)胞形態(tài)及分子標(biāo)志表達(dá)。(1)接種24小時(shí)后細(xì)胞貼壁，3天后多見(jiàn)梭形和多角形細(xì)胞，9天后長(zhǎng)梭形細(xì)胞增多，相鄰集落融合。所觀察的細(xì)胞形態(tài)符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征。(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，本實(shí)

5、驗(yàn)分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面表達(dá)CD29(99.8％)、CD90(100％);低表達(dá)CD34(1.4％)和CD45(0.2％)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原特征。
　　二:培養(yǎng)環(huán)境對(duì)BMSCs和HUMSCs增殖能力的影響。C組細(xì)胞增殖最快，B、D兩組較慢，平臺(tái)期A、C兩組差值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),A、C和B、D兩組的差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。B、D兩組的細(xì)胞形態(tài)明顯發(fā)生改變，細(xì)胞收縮，排列無(wú)序。
　　三:高脂

6、高糖對(duì)BMSCs和HUMSCs誘導(dǎo)成骨分化的影響(1)4組細(xì)胞的ALP染色均呈陽(yáng)性，但B、D兩組陽(yáng)性較弱。(2)4組細(xì)胞茜素紅染色均呈陽(yáng)性，但B、D兩組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量較少，形態(tài)較小。(3)4組細(xì)胞的Ⅰ型膠原蛋白染色均呈陽(yáng)性，但B、D兩組所染的棕黃色較淺。(4)4組細(xì)胞的ALP活性表達(dá)趨勢(shì)相同，均在成骨誘導(dǎo)第10天達(dá)到峰值，第15天明顯回落。但B、D兩組表達(dá)量較低，同A、C兩組的差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(5)4組細(xì)胞均表達(dá)骨鈣素基

7、因，其中A、C兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，B、D兩組表達(dá)量較低，同A、C兩組的差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P＜0.05)
　　結(jié)論:
　　1.常規(guī)培養(yǎng)條件下HUMSCs的增值速度比BMSCs更快。2.在高糖高脂環(huán)境下，BMSCs和HUMSCs的增殖活性均降低，但無(wú)差異。3.高糖高脂環(huán)境下，BMSCs和HUMSCc雖然成骨分化的活力受損，但仍具有成骨能力。4.高糖高脂環(huán)境下，HUMSCs和BMSCs的成骨能力未見(jiàn)顯著區(qū)別。5.