人臍帶間充質干細胞對高糖致足細胞凋亡的作用.pdf

1、背景:糖尿病腎病(DN)是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥，隨糖尿病發(fā)病率升高，DN已成為終末期腎病(ESRD)的主要病因。研究表明，在DN的發(fā)生和發(fā)展中，足細胞凋亡與蛋白尿的產生密切相關，改善和維持足細胞的正常結構和功能可以改善糖尿病腎損傷。臨床上DN的治療以降低血糖、控制血壓和減少蛋白尿等對癥治療及腎臟替代治療為主，目前尚無令人滿意的治療方法。間充質干細胞(MSCs)具有亞全能分化潛能，廣泛用于多種疾病的治療，也為DN的治療提供了新方向

2、。研究證明，MSCs移植可以降低糖尿病大鼠血糖，減少蛋白尿，改善腎損傷，但其具體機制仍不明確。我們采用高糖刺激足細胞建立凋亡模型，通過MSCs和足細胞共培養(yǎng)探討MSCs對足細胞凋亡的影響及其作用機制。
　　目的:探討人臍帶間充質干細胞(HUC-MSCs)對高糖誘導的足細胞凋亡的影響及其作用機制。
　　方法:采用貼壁法制備人臍帶間充質干細胞，對獲取的HUC-MSCs通過細胞形態(tài)觀察，多向分化（成骨誘導分化和成脂誘導分化），流式

3、細胞儀檢測細胞表型進行鑒定。小鼠足細胞分為4組:(1)正常糖組(NG);(2)高糖組(HG);(3)甘露醇滲透壓對照組(NG+MA);(4) HUC-MSCs和足細胞transwell共培養(yǎng)組(HUC-MSCs)。分別刺激72h后，檢測足細胞凋亡指標，包括蛋白印跡法檢測凋亡相關蛋白PARP、Bcl-2的表達，采用流式細胞術檢測足細胞凋亡率，Hoechst染色檢測足細胞凋亡水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測HUC-MSCs分泌HG

4、F水平。同時，采用HGF抗體中和HGF以消除其作用，或加入rhHGF模擬MSC作用，探討HGF在HUC-MSCs抗凋亡機制中的作用。
　　結果:1.制備培養(yǎng)的HUC-MSCs呈長梭形，平行或漩渦狀排列;油紅O染色發(fā)現(xiàn)細胞漿有染成紅色的油滴空泡;茜素紅染色發(fā)現(xiàn)細胞漿中有染成酒紅色的鈣沉積;流式細胞術檢測HUC-MSCs高表達常用的人間充質干細胞標記CD90(98.5％)，CD105(64.3％)，CD73(96.3％);不表達造血細

5、胞標記CD34(0.3％)，CD45(0.5％)。
　　2.高糖刺激24、48、72h后，足細胞PARP的表達增多，且隨刺激時間延長而持續(xù)增高。各實驗組處理72h后，檢測凋亡相關指標。免疫印跡法顯示:與NG組比較，HG組凋亡標志蛋白PARP的表達增多、Bcl-2表達減少(P＜0.05)，與HG組比較，HUC-MSCs共培養(yǎng)組PARP的表達減少、Bcl-2表達增加(P＜0.05)。流式細胞術顯示:與NG組比較，HG組足細胞凋亡率增多

6、（P＜0.05）;與HG組比較，HUC-MSCs共培養(yǎng)組足細胞凋亡率減少(P＜0.05)。Hoechst染色顯示:HG組足細胞細胞核出現(xiàn)花瓣狀或固縮變小，呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài); HUC-MSCs共培養(yǎng)組細胞核形態(tài)正常，呈長橢圓形，無凋亡細胞核改變。與NG組比較，HG組足細胞凋亡率增多(P＜0.05);與HG組比較，HUC-MSCs共培養(yǎng)組足細胞凋亡率減少(P＜0.05)。NG+Ma組無上述凋亡指標的改變。
　　3.ELISA檢測HUC

7、-MSCs分泌大量HGF。加入rhHGF后，與高糖組比較，rhHGF組PARP的表達減少、Bcl-2表達增加(P＜0.05)，足細胞凋亡率減少(P＜0.05)，細胞核形態(tài)正常，呈長橢圓形，無凋亡細胞核改變。與HUC-MSCs組比較，加入HGF中和抗體后PARP的表達增多，Bcl-2表達減少(P＜0.05)足細胞凋亡率增多（P＜0.05），足細胞細胞核出現(xiàn)花瓣狀或固縮變小，呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)。
　　結論:1.HUC-MSCs可以減輕高