脂多糖對人臍帶間充質(zhì)干細胞凋亡的影響及調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的:通過組織塊法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umibilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs),并用不同濃度脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)刺激細胞,探討 LPS對 hUCMSCs細胞增殖、凋亡的影響及其調(diào)控機制。研究低濃度LPS預(yù)處理對hUCMSCs的適應(yīng)性保護作用,并探討其潛在機制,為增強hUCMSCs的內(nèi)毒素耐受性提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:

2、1、利用組織塊法從足月兒臍帶中分離培養(yǎng) hUCMSCs。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài);MTT法檢測第3、5、10代細胞增殖活性;免疫熒光染色法測定細胞表面標記物。
　　2、采用不同濃度LPS(0、0.01、0.1、1.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg/ml)刺激hUCMSCs。MTT法檢測細胞增殖活性;AO/EB染色法及流式細胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測細胞凋亡情況;酶聯(lián)免疫吸附法( enz

3、yme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測Caspase-8、Caspase-3活性及DNA片段。
　　3、低濃度LPS(0.1、1.0、10.0、20.0μg/ml)預(yù)處理12h后,再給予hUCMSCs50.0μg/ml LPS作用24h。FCM及Hoechst染色法檢測細胞凋亡情況;MTT法檢測細胞的存活率。
　　4、低濃度LPS(0.1、1.0、10.0、20.0μg/ml)預(yù)處理

4、12h,或再給予hUCMSCs50.0μg/ml LPS作用24h,或給予si-FLIPL及NF-κB特異性抑制劑PDTC,Western blot檢測c-FLIPL和NF-κBp65蛋白表達變化情況;FCM檢測細胞凋亡變化情況;ELISA檢測Caspase-8、Caspase-3活性變化情況。
　　結(jié)果:1、組織塊法分離培養(yǎng)出成纖維樣細胞,呈貼壁漩渦樣生長。第3、5、10代細胞增殖快速,趨勢皆呈“S”型。細胞高表達CD105、C

5、D90、CD73和CD44,低表達HLA-I;不表達CD31、CD45和HLA-DR。
　　2、MTT結(jié)果顯示,與對照組比較,0.01-10.0μg/ml LPS干預(yù)組吸光度值(A值)明顯增高(P<0.05或P<0.01),其中1.0μg/ml LPS干預(yù)組最高(P<0.01);而20.0μg/ml LPS干預(yù)組無明顯變化(P>0.05),30.0-50.0μg/ml LPS干預(yù)組A值明顯降低(P<0.01)。AO/EB示,0-1

6、0.0μg/ml LPS干預(yù)組未見明顯凋亡細胞,20.0-50.0μg/ml LPS干預(yù)組可見明顯細胞凋亡。FCM示:與對照組〔(2.68±0.27)％〕比較,1.0μg/ml LPS干預(yù)組細胞凋亡率〔(3.07±0.35)%〕無明顯差異(P>0.05),而30.0及50.0μg/ml LPS干預(yù)組凋亡率〔(8.92±3.77)%、(23.46±2.38)%〕明顯增高(P<0.01)。ELISA結(jié)果示:50.0μg/ml LPS明顯提高

7、了hUCMSCs Caspase-8、Caspase-3活性及DNA片段化程度(P<0.01),但Caspase-8抑制劑z-IETD-FMK可顯著降低其水平(P<0.01)。
　　3、FCM結(jié)果示:與未預(yù)處理組比較,0.1和1.0μg/ml LPS預(yù)處理組hUCMSCs細胞凋亡率明顯下降(P<0.01),而10.0和20.0μg/ml LPS預(yù)處理組細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)。Hoechst染色顯示,1.0μg/ml

8、LPS預(yù)處理可顯著降低50.0μg/ml LPS引起的細胞凋亡。MTT結(jié)果示,1.0μg/ml LPS預(yù)處理可使50.0μg/ml LPS引起的 hUCMSCs存活率從(62.42±6.62)%上升至(84.15±6.30)%(P<0.01)。
　　4、與對照組比較,0.1和1.0μg/ml LPS預(yù)處理組hUCMSCs中c-FLIPL蛋白表達明顯升高(P<0.01);且1.0μg/ml LPS預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)50.0μg/ml LP

9、S誘導(dǎo)的c-FLIPL蛋白表達下降(P<0.01)。si-FLIPL可顯著降低1.0μg/ml LPS預(yù)處理引起的c-FLIPL高表達水平(P<0.01),并減弱1.0μg/ml LPS預(yù)處理抗細胞凋亡的能力。PDTC可同時下調(diào)1.0μg/ml LPS預(yù)處理引起的NF-κBp65和c-FLIPL高表達水平(P<0.01)。
　　結(jié)論:通過組織塊法從人臍帶中成功分離、培養(yǎng)出 hUCMSCs。LPS對hUCMSCs細胞增殖具有濃度依賴